ESTERILIZAÇÃO POR ÓXIDO DE ETILENO
Publicado em 18 de agosto de 2011 por HUGO CAMPOS OLIVEIRA SANTOS
VALIDAÇÃO DA ESTERILIZAÇÃO POR ÓXIDO DE ETILENO EM FRASCOS ENTERAIS PARA REDUZIR O TEMPO DE AERAÇÃO EM NÍVEIS RESIDUAIS SEGUROS
Nomes: SANTOS, Hugo Campos Oliveira; TACON, Kelly Cristina Borges; AMARAL Waldemar Naves; CASTRO, Eduardo Camelo; CUNHA Luiz Carlos.
Unidade acadêmica: Faculdade de Medicina; Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da UFG.
Endereço eletrônico: [email protected]
PALAVRAS - CHAVE: Validação. Esterilização. Óxido de Etileno. Cromatografia Gasosa
INDRODUÇÃO
O processo de esterilização tem a finalidade de remover ou destruir todas as formas de vida microbiana para um nível de esterilidade segura1. A esterilização pode ser feita mediante a aplicação de calor seco ou úmido, agentes gasosos, químicos e físicos e todos os processos devem ser validados2.
O óxido de etileno (EtO) descoberto por Wurtz em 1859, começou a ser produzido comercialmente em 1921 e a partir de 1962 foi adotado como método de esterilização para materiais sensíveis ao calor3. O EtO exerce ação letal através de alquilação, principalmente em ácido nucléicos, impedindo a síntese de proteínas e destruindo esporos, bactérias, fungos e vírus4, tornado-se um método seguro e eficaz5.
O uso do Bioindicador rápido (terceira geração) permite ganho de tempo e produtividade e para comprovar a eficiência da esterilização foi realizada a validação do processo através da qualificação física, microbiológica e química.
MATERIAL E MÉTODOS
Trata-se de estudo quantitativo de análise descritiva realizado na FBM indústria farmacêutica na cidade de Anápolis-GO. Os resultados foram expressos em média ±DP e DPR% pelos Programas Graphpad Instat 3.0 teste (Turkey Kramer) e Biostat 4.0 teste (Shapiro Wilk), considerando significativo p <0,05. Os materiais utilizados foram o Frasco enteral 300 ml (lote 80334, 80335 e 80336), Autoclave EtO de 6.000 Litros (FBMFARMA), béquer 100, 250 e 500 ml, bioindicador rápido 1264 (3M), cromatógrafo gasoso (Young Lin, 6100 series), clipador (Wheaton E-Z Crimper), declipador (Kebby Decapper), incubadora rápida (3M) , Integrador químico classe IV (Browne), máscara facial 6899-B (3M), padrão EtO 5.000 ppm (SOLUTECH) lotes 2695/2696, papel grau cirúrgico (Rexan), pipeta Automática (Labmate) 100 µL e 500 µL, ponteira descartável e vial.
Para a amostragem os sensores, as amostras e os integradores físicos foram posicionados dentro da autoclave para qualificação física nas posições: 1DA, 1AD, 2AA, 2DD, 3AC, 3CC, 3DC, 4AD, 4DA, 5AA e 5DD. Para a qualificação química foram utilizados n (54) Frascos Enterais de 300 ml para determinar o tempo de aeração.
Validação do Método Analítico
O método analítico fundamenta-se na metodologia descrita por Nagaroto & Penna e foi validado seguindo as recomendações ANVISA7 e faixa de aplicação conforme limite da USP 30 utilizando EtO como padrão de trabalho 10 µg/ml.
A validação do método GCFID foi estabelecida seguindo as recomendações para categoria II, à qual reporta para metodologia de quantificação de fármaco em medicamentos que sejam avaliados os parâmetros de especificidade, linearidade, precisão intra-corrida e inter-corridas, exatidão, robustez, limite de detecção e limite de quantificação.
O sistema de análise utilizado foi a cromatografia gasosa Young Lin 6100 series; software Windows alta vista e condições cromatográficas conforme metodologia validada6 e sistema composto de forno com temperatura inicial de 60ºC, com tempo de equilíbrio de 1 minuto, rampa de 20,00°C por minuto, temperatura final de 230°C e tempo de análise de 11 minutos; coluna (ZBWax): fluxo constante arraste de 1,8 ml/ min. nas dimensões de 30mx0,25mmx0,25µm (filme) para gás de arraste nitrogênio, detector de chama por ionização (FID): temperatura de 250ºC, fluxo de hidrogênio de 30 ml/min e fluxo de ar sintético de 300 ml/min.
Será aprovado o tempo de aeração com resultados analisados que permitirem a dissipação residual no limite de 10 µg/ml em relação ao menor tempo, estabelecido na concentração observada e a calculada através dos cromatogramas obtidos de acordo com os critérios da farmacopéia americana8. Após a esterilização, as amostras foram colocadas em sala de aeração a 55°C e 27 trocas de ar por hora onde foram retiradas nos tempos: 0, 4, 6, 12, 24 e 48 horas. Cada amostra foi preparada completando o volume de 300 ml do frasco enteral com água ultra pura (C.E. ≥18,2 Mohm.cm). Foram injetados no cromatógrafo separadamente 1 µL de solução branco, solução padrão de trabalho EtO e soluções das amostras preparadas. Através das áreas dos picos referentes aos cromatogramas foi calculado o EtO residual, conforme fórmula:
Onde: EtO: valor obtido (ppm); Aa: área do pico referente ao EtO obtido na amostra; Ap: área do pico da solução padrão; Cp: concentração padrão; V: volume do frasco; P: peso do frasco (gramas).
RESULTADOS
Para a qualificação física os 11 sensores físicos e 11 integradores implantados aprovaram os parâmetros de qualificação: 45 UR%, temperatura: 55ºC, pressão: 0,750 Kgf/cm² e concentração EtO: 430 mg/l.
Para a qualificação microbiológica os testes de esterilidade foram aprovados nas análises amostradas para os ciclos: 534, 535 e 536 na metodologia de meios de cultura Tioglicolato Fluido e TSB no período de 14 dias. Todas as 33 amostras foram aprovadas no ensaio de endotoxina com resultados abaixo de < 0,5 EU/ml conforme USP 30. A avaliação das análises de 33 Bioindicadores rápidos 1294 (terceira geração) com leitura de 4 horas indicou a aprovação dos ciclos de esterilização 534, 535 e 536, confirmando o SAL 10-12 de 360 minutos e valor D de 30 minutos, para a exposição de 6 horas ao agente esterilizante óxido de etileno na concentração de 430 mg/L.
A validação analítica foi aprovada para todos os parâmetros analisados. A especificidade foi aprovada para as degradações em meio básico: (-40,07%), ácido (-43,68%), oxidante (-23,28%) e sob temperaturas elevadas (-14,77%). A análise de Linearidade foi aprovada pois, as amostras apresentaram DPR% <5 e coeficiente de correlação (r) de 0,999, calculado com as médias das triplicatas.
A precisão foi aprovada para o grau de concordância obtidas com a análise do padrão EtO de trabalho tanto nos ensaios intra-corrida como inter-corrida, os valores do DPR % em ambos os casos foram menores que 5%. A avaliação da exatidão foi realizada pela recuperação de óxido de etileno nas concentrações de 80, 100 e 120% da concentração de trabalho para 100,4, 101,2 e 99,6 dentro do critério aceitação: 98,0 a 102,0% conforme RE 899 da ANVISA.
As alterações deliberadas nos parâmetros cromatográficos proporcionaram resultados dentro do critério de aceitação DPR% <5 para as 7 metodologias propostas (R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R8), ensaiadas por conveniência para determinar a concentração do padrão de trabalho EtO 10 µg/ml, demonstrando boa separação e simetria dos picos aprovando assim a robustez do método.
O menor nível detectado foi de 0,3 µg/mL ? área 0,9599 mv*s (ruído 0,1 µg/mL) e o valor quantificável foi 1,0 µg/mL.
Para a qualificação química foi realizado a avaliação do processo de aeração e os resultados demonstraram que a partir de 6 horas de aeração os produtos podem ser liberados e utilizados com níveis residuais seguros e validados, ou seja, valores menores que 10 ppm. Nota-se que quanto maior a temperatura na sala de aeração e maior eficiência do sistema de troca de ar, menor será o tempo de aeração.
DISCUSSÃO
Através do método de análise cromatografia gasosa obtiveram-se resultados que permitem avaliar a segurança residual de EtO a partir de 6 horas de aeração a 55°C e 28 trocas de ar/hora, determinados em frascos enterais o que representa ganho de tempo e produtividade quando comparados ao estudo realizado por Martins et al 9,10,11,12que determinou os níveis de EtO em cânulas e obteve o tempo de 19 horas em aeração.
O tempo de aeração depende do material do produto e metodologia do sistema de aeração que pode ser adaptada para cada situação, o que confirmar as diferenças de difusibilidade do óxido de etileno para o frasco enteral e as cânulas. Esta diferença é justificada pela temperatura de 55°C para o tempo de 6 horas e 35ºC para o tempo de 19 horas 10,11,12,13.
Além disso, a remoção de EtO na autoclave através de 14 pulsos ar/vácuo (pré-aeração) fizeram com que a concentração de EtO inicial fosse reduzida na autoclave, o que aumentou a eficiência do processo aeração 10,11,12.
A revisão dos principais riscos da utilização do óxido de etileno em materiais médicos enfatizam medidas de controle de risco e citaram estudos realizados em trabalhadores expostos ao EtO que apresentaram maior incidência de neoplasia. Estes estudos ressaltam a toxicidade do EtO tanto para trabalhadores como para usuários dos produtos esterilizados confirmando a necessidade de validação da esterilização e principalmente a comprovação de segurança residual 14,15,16. O bioindicador rápido proporciona a aprovação do ciclo de esterilização a partir de 6 horas de aeração em limites residuais seguros, o que proporcionou ganho de produtividade e segurança operacional quando comparado ao tempo anterior de 48 horas do bioindicador convencional 1264.
CONCLUSÃO
Todas as etapas da validação foram alcançadas com sucesso para as qualificações física, microbiológica e química residual. A metodologia para análise residual GCFID foi validada com sucesso e a dissipação residual demonstrou eficiência e reprodutibilidade a partir do tempo de 6 horas de aeração para o frasco enteral, para o critério permitido de 10 µg/mL.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 ? Padoveze, M. C. (2003) "Aspectos Gerais: esterilização de artigos em unidades de saúde" em "APECIH", págs. 2-18.
2 - Brasil, MS, ANVISA (2003) Resolução nº 210 de 04/08/2003, D.O.U de 14/08/2003. Regulamento técnico das boas práticas para a fabricação de medicamentos.
3 ? Herance, G. et al. (1990) "Esterilización com oxide de etileno: Repurcusiones em El âmbito hospitalario. Rev. Enf, 13 (138): págs. 19-22.
4 ? Zanon, U. N. J. (1987) "Infecções hospitalares: prevenção, diagnóstico e tratamento, Rio de Janeiro, págs. 831-858.
5 ? Possari, J. F. (2003) "Esterilização por óxido de etileno", Rio de Janeiro, pág. 86.
6 - Nagaroto, S. L. & Penna T. C. V. (2006) "Desinfecção e Esterilização" São Paulo: Editora Atheneu.
7 - Brasil, MS, ANVISA (2003) Resolução nº 899 de 29/05/2003, D.O.U. de 02/06/2003. Guia paravalidação de métodos analíticos e bioanalíticos.
8 - The United States Pharmacopeia ? USP, 30. Rockville, United States Pharmacopeia Convention, Easton: Mark, cap. 467, 2007.
9 - Martins, A. M. S. et al. (2003) Latinoamer Tecnol Extracorp 10:4
10 - Association for the Advancement of Medical Instrumentation (2007) Medical devices - Validation and routine control of ethylene oxide sterilization: ISO 11135, Arlington.
11 - Association for the Advancement of Medical Instrumentation (1994) Sterilization of health care products - Biological indicators - Part 1: General requirements: ISO 11138, Arlington.
12 - Association for the Advancement of Medical Instrumentation (2001) Biological evaluation of medical devices - Part 7: Ethylene oxide sterilization residual: ISO 10993-7, Arlington.
13 ? Tock, R. M. & Chen, Y. C. (1974) "Aeration if medical plastic" J Biomed Mater Res, pág. 69-80.
14 ? Marín, A. P. & Gallén, P. S. (1987) Rev. Saúde Pública vol.21 n.6 São Paulo
15 ? Thiess, A. M. et al. (1981) In: Internal Symposiun on Prevention of Occupational Cancer, Proceedings. Helsinki, Finland, pags. 249-59.
16 - Morgan, R. W. et al. (1981) J. occup. Med., 23: 767-70.
Nomes: SANTOS, Hugo Campos Oliveira; TACON, Kelly Cristina Borges; AMARAL Waldemar Naves; CASTRO, Eduardo Camelo; CUNHA Luiz Carlos.
Unidade acadêmica: Faculdade de Medicina; Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da UFG.
Endereço eletrônico: [email protected]
PALAVRAS - CHAVE: Validação. Esterilização. Óxido de Etileno. Cromatografia Gasosa
INDRODUÇÃO
O processo de esterilização tem a finalidade de remover ou destruir todas as formas de vida microbiana para um nível de esterilidade segura1. A esterilização pode ser feita mediante a aplicação de calor seco ou úmido, agentes gasosos, químicos e físicos e todos os processos devem ser validados2.
O óxido de etileno (EtO) descoberto por Wurtz em 1859, começou a ser produzido comercialmente em 1921 e a partir de 1962 foi adotado como método de esterilização para materiais sensíveis ao calor3. O EtO exerce ação letal através de alquilação, principalmente em ácido nucléicos, impedindo a síntese de proteínas e destruindo esporos, bactérias, fungos e vírus4, tornado-se um método seguro e eficaz5.
O uso do Bioindicador rápido (terceira geração) permite ganho de tempo e produtividade e para comprovar a eficiência da esterilização foi realizada a validação do processo através da qualificação física, microbiológica e química.
MATERIAL E MÉTODOS
Trata-se de estudo quantitativo de análise descritiva realizado na FBM indústria farmacêutica na cidade de Anápolis-GO. Os resultados foram expressos em média ±DP e DPR% pelos Programas Graphpad Instat 3.0 teste (Turkey Kramer) e Biostat 4.0 teste (Shapiro Wilk), considerando significativo p <0,05. Os materiais utilizados foram o Frasco enteral 300 ml (lote 80334, 80335 e 80336), Autoclave EtO de 6.000 Litros (FBMFARMA), béquer 100, 250 e 500 ml, bioindicador rápido 1264 (3M), cromatógrafo gasoso (Young Lin, 6100 series), clipador (Wheaton E-Z Crimper), declipador (Kebby Decapper), incubadora rápida (3M) , Integrador químico classe IV (Browne), máscara facial 6899-B (3M), padrão EtO 5.000 ppm (SOLUTECH) lotes 2695/2696, papel grau cirúrgico (Rexan), pipeta Automática (Labmate) 100 µL e 500 µL, ponteira descartável e vial.
Para a amostragem os sensores, as amostras e os integradores físicos foram posicionados dentro da autoclave para qualificação física nas posições: 1DA, 1AD, 2AA, 2DD, 3AC, 3CC, 3DC, 4AD, 4DA, 5AA e 5DD. Para a qualificação química foram utilizados n (54) Frascos Enterais de 300 ml para determinar o tempo de aeração.
Validação do Método Analítico
O método analítico fundamenta-se na metodologia descrita por Nagaroto & Penna e foi validado seguindo as recomendações ANVISA7 e faixa de aplicação conforme limite da USP 30 utilizando EtO como padrão de trabalho 10 µg/ml.
A validação do método GCFID foi estabelecida seguindo as recomendações para categoria II, à qual reporta para metodologia de quantificação de fármaco em medicamentos que sejam avaliados os parâmetros de especificidade, linearidade, precisão intra-corrida e inter-corridas, exatidão, robustez, limite de detecção e limite de quantificação.
O sistema de análise utilizado foi a cromatografia gasosa Young Lin 6100 series; software Windows alta vista e condições cromatográficas conforme metodologia validada6 e sistema composto de forno com temperatura inicial de 60ºC, com tempo de equilíbrio de 1 minuto, rampa de 20,00°C por minuto, temperatura final de 230°C e tempo de análise de 11 minutos; coluna (ZBWax): fluxo constante arraste de 1,8 ml/ min. nas dimensões de 30mx0,25mmx0,25µm (filme) para gás de arraste nitrogênio, detector de chama por ionização (FID): temperatura de 250ºC, fluxo de hidrogênio de 30 ml/min e fluxo de ar sintético de 300 ml/min.
Será aprovado o tempo de aeração com resultados analisados que permitirem a dissipação residual no limite de 10 µg/ml em relação ao menor tempo, estabelecido na concentração observada e a calculada através dos cromatogramas obtidos de acordo com os critérios da farmacopéia americana8. Após a esterilização, as amostras foram colocadas em sala de aeração a 55°C e 27 trocas de ar por hora onde foram retiradas nos tempos: 0, 4, 6, 12, 24 e 48 horas. Cada amostra foi preparada completando o volume de 300 ml do frasco enteral com água ultra pura (C.E. ≥18,2 Mohm.cm). Foram injetados no cromatógrafo separadamente 1 µL de solução branco, solução padrão de trabalho EtO e soluções das amostras preparadas. Através das áreas dos picos referentes aos cromatogramas foi calculado o EtO residual, conforme fórmula:
Onde: EtO: valor obtido (ppm); Aa: área do pico referente ao EtO obtido na amostra; Ap: área do pico da solução padrão; Cp: concentração padrão; V: volume do frasco; P: peso do frasco (gramas).
RESULTADOS
Para a qualificação física os 11 sensores físicos e 11 integradores implantados aprovaram os parâmetros de qualificação: 45 UR%, temperatura: 55ºC, pressão: 0,750 Kgf/cm² e concentração EtO: 430 mg/l.
Para a qualificação microbiológica os testes de esterilidade foram aprovados nas análises amostradas para os ciclos: 534, 535 e 536 na metodologia de meios de cultura Tioglicolato Fluido e TSB no período de 14 dias. Todas as 33 amostras foram aprovadas no ensaio de endotoxina com resultados abaixo de < 0,5 EU/ml conforme USP 30. A avaliação das análises de 33 Bioindicadores rápidos 1294 (terceira geração) com leitura de 4 horas indicou a aprovação dos ciclos de esterilização 534, 535 e 536, confirmando o SAL 10-12 de 360 minutos e valor D de 30 minutos, para a exposição de 6 horas ao agente esterilizante óxido de etileno na concentração de 430 mg/L.
A validação analítica foi aprovada para todos os parâmetros analisados. A especificidade foi aprovada para as degradações em meio básico: (-40,07%), ácido (-43,68%), oxidante (-23,28%) e sob temperaturas elevadas (-14,77%). A análise de Linearidade foi aprovada pois, as amostras apresentaram DPR% <5 e coeficiente de correlação (r) de 0,999, calculado com as médias das triplicatas.
A precisão foi aprovada para o grau de concordância obtidas com a análise do padrão EtO de trabalho tanto nos ensaios intra-corrida como inter-corrida, os valores do DPR % em ambos os casos foram menores que 5%. A avaliação da exatidão foi realizada pela recuperação de óxido de etileno nas concentrações de 80, 100 e 120% da concentração de trabalho para 100,4, 101,2 e 99,6 dentro do critério aceitação: 98,0 a 102,0% conforme RE 899 da ANVISA.
As alterações deliberadas nos parâmetros cromatográficos proporcionaram resultados dentro do critério de aceitação DPR% <5 para as 7 metodologias propostas (R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R8), ensaiadas por conveniência para determinar a concentração do padrão de trabalho EtO 10 µg/ml, demonstrando boa separação e simetria dos picos aprovando assim a robustez do método.
O menor nível detectado foi de 0,3 µg/mL ? área 0,9599 mv*s (ruído 0,1 µg/mL) e o valor quantificável foi 1,0 µg/mL.
Para a qualificação química foi realizado a avaliação do processo de aeração e os resultados demonstraram que a partir de 6 horas de aeração os produtos podem ser liberados e utilizados com níveis residuais seguros e validados, ou seja, valores menores que 10 ppm. Nota-se que quanto maior a temperatura na sala de aeração e maior eficiência do sistema de troca de ar, menor será o tempo de aeração.
DISCUSSÃO
Através do método de análise cromatografia gasosa obtiveram-se resultados que permitem avaliar a segurança residual de EtO a partir de 6 horas de aeração a 55°C e 28 trocas de ar/hora, determinados em frascos enterais o que representa ganho de tempo e produtividade quando comparados ao estudo realizado por Martins et al 9,10,11,12que determinou os níveis de EtO em cânulas e obteve o tempo de 19 horas em aeração.
O tempo de aeração depende do material do produto e metodologia do sistema de aeração que pode ser adaptada para cada situação, o que confirmar as diferenças de difusibilidade do óxido de etileno para o frasco enteral e as cânulas. Esta diferença é justificada pela temperatura de 55°C para o tempo de 6 horas e 35ºC para o tempo de 19 horas 10,11,12,13.
Além disso, a remoção de EtO na autoclave através de 14 pulsos ar/vácuo (pré-aeração) fizeram com que a concentração de EtO inicial fosse reduzida na autoclave, o que aumentou a eficiência do processo aeração 10,11,12.
A revisão dos principais riscos da utilização do óxido de etileno em materiais médicos enfatizam medidas de controle de risco e citaram estudos realizados em trabalhadores expostos ao EtO que apresentaram maior incidência de neoplasia. Estes estudos ressaltam a toxicidade do EtO tanto para trabalhadores como para usuários dos produtos esterilizados confirmando a necessidade de validação da esterilização e principalmente a comprovação de segurança residual 14,15,16. O bioindicador rápido proporciona a aprovação do ciclo de esterilização a partir de 6 horas de aeração em limites residuais seguros, o que proporcionou ganho de produtividade e segurança operacional quando comparado ao tempo anterior de 48 horas do bioindicador convencional 1264.
CONCLUSÃO
Todas as etapas da validação foram alcançadas com sucesso para as qualificações física, microbiológica e química residual. A metodologia para análise residual GCFID foi validada com sucesso e a dissipação residual demonstrou eficiência e reprodutibilidade a partir do tempo de 6 horas de aeração para o frasco enteral, para o critério permitido de 10 µg/mL.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 ? Padoveze, M. C. (2003) "Aspectos Gerais: esterilização de artigos em unidades de saúde" em "APECIH", págs. 2-18.
2 - Brasil, MS, ANVISA (2003) Resolução nº 210 de 04/08/2003, D.O.U de 14/08/2003. Regulamento técnico das boas práticas para a fabricação de medicamentos.
3 ? Herance, G. et al. (1990) "Esterilización com oxide de etileno: Repurcusiones em El âmbito hospitalario. Rev. Enf, 13 (138): págs. 19-22.
4 ? Zanon, U. N. J. (1987) "Infecções hospitalares: prevenção, diagnóstico e tratamento, Rio de Janeiro, págs. 831-858.
5 ? Possari, J. F. (2003) "Esterilização por óxido de etileno", Rio de Janeiro, pág. 86.
6 - Nagaroto, S. L. & Penna T. C. V. (2006) "Desinfecção e Esterilização" São Paulo: Editora Atheneu.
7 - Brasil, MS, ANVISA (2003) Resolução nº 899 de 29/05/2003, D.O.U. de 02/06/2003. Guia paravalidação de métodos analíticos e bioanalíticos.
8 - The United States Pharmacopeia ? USP, 30. Rockville, United States Pharmacopeia Convention, Easton: Mark, cap. 467, 2007.
9 - Martins, A. M. S. et al. (2003) Latinoamer Tecnol Extracorp 10:4
10 - Association for the Advancement of Medical Instrumentation (2007) Medical devices - Validation and routine control of ethylene oxide sterilization: ISO 11135, Arlington.
11 - Association for the Advancement of Medical Instrumentation (1994) Sterilization of health care products - Biological indicators - Part 1: General requirements: ISO 11138, Arlington.
12 - Association for the Advancement of Medical Instrumentation (2001) Biological evaluation of medical devices - Part 7: Ethylene oxide sterilization residual: ISO 10993-7, Arlington.
13 ? Tock, R. M. & Chen, Y. C. (1974) "Aeration if medical plastic" J Biomed Mater Res, pág. 69-80.
14 ? Marín, A. P. & Gallén, P. S. (1987) Rev. Saúde Pública vol.21 n.6 São Paulo
15 ? Thiess, A. M. et al. (1981) In: Internal Symposiun on Prevention of Occupational Cancer, Proceedings. Helsinki, Finland, pags. 249-59.
16 - Morgan, R. W. et al. (1981) J. occup. Med., 23: 767-70.