Composição da microbiota intestinal em resposta à dieta hiperlipídica e estresse em um modelo de camundongo

Diferenças baseadas no gênero no comportamento do hospedeiro e na composição da microbiota intestinal em resposta à dieta hiperlipídica e estresse em um modelo de camundongo

Resumo

A obesidade está associada a uma alta prevalência de transtornos do humor, como ansiedade e depressão. Tanto o estresse quanto a dieta rica em gorduras podem alterar a microbiota intestinal e contribuir para a obesidade. Para examinar as inter-relações entre obesidade, estresse, microbiota intestinal e transtornos do humor, a obesidade foi induzida em camundongos usando uma dieta rica em gordura, e os ratos foram subsequentemente estressados ​​usando um protocolo de estresse leve e crônica. Durante o experimento, a composição da microbiota intestinal foi analisada pelo sequenciamento de alto rendimento do gene 16S rRNA, e os comportamentos semelhantes à ansiedade foram medidos. Os resultados revelaram diferenças distintas de gênero nos impactos da obesidade e do estresse sobre comportamentos semelhantes à ansiedade, níveis de atividade e composição da microbiota intestinal. Camundongos machos foram mais vulneráveis ​​aos efeitos ansiogênicos da dieta hiperlipídica, e camundongos obesos do sexo masculino apresentaram diminuição da atividade de locomoção em resposta ao estresse, enquanto que camundongos fêmeas obesos não o fizeram. Nas mulheres, o estresse fez com que a microbiota intestinal de camundongos magros se parecesse mais com a dos ratos obesos. Em conjunto, esses resultados sugerem a importância de considerar o gênero como uma variável biológica em estudos sobre o papel da microbiota intestinal em transtornos do humor relacionados à obesidade.

Introdução

Evidências convergentes indicam que uma microbiota intestinal disbiótica contribui para a obesidade e seus fenótipos metabólicos associados, incluindo doença cardíaca, resistência à insulina, fígado gordo e inflamação sistêmica. Por exemplo, o transplante de microbiota intestinal de camundongos obesos ou humanos aumentou os depósitos de gordura em camundongos sem germes receptores. O tratamento antibiótico para alterar a microbiota intestinal reduziu a obesidade, a resistência à insulina e a inflamação sistêmica em camundongos alimentados com dieta rica em gordura. Em humanos, o transplante de microbiota intestinal de doadores magros melhorou a sensibilidade à insulina periférica e hepática em receptores obesos.

A obesidade, por sua vez, está associada a uma alta prevalência de transtornos do humor, como ansiedade e depressão. A associação de transtornos do humor com a obesidade foi replicada em vários modelos de roedores e propôs mecanismos fisiopatológicos para a conexão que incluem produção excessiva de citocinas pró-inflamatórias que indiretamente afetam a produção de serotonina, níveis elevados de leptina atuando nos receptores de leptina no cérebro, neuroinflamação como extensão da inflamação sistêmica que comumente acompanha a obesidade e alterações induzidas pela dieta hiperlipídica na sinalização de glicocorticóides no hipocampo. O tecido adiposo pode secretar citocinas proinflamatórias e leptina, fornecendo uma via pela qual o tecido adiposo pode modular diretamente a função neurológica, mas o transplante de microbiota intestinal de camundongos obesos em dieta hiperlipídica (HFD) produziu mudanças comportamentais em camundongos receptores, embora os receptores não desenvolver obesidade, sugerindo que a microbiota intestinal também pode modular diretamente algumas das complicações neurológicas da obesidade.

O estresse, como a DH, pode alterar a composição da microbiota intestinal. O estresse também pode desencadear transtornos de humor como ansiedade e depressão e pode promover a obesidade, sugerindo que o impacto do estresse nos transtornos de humor e obesidade pode ser atribuído, pelo menos em parte, às mudanças que causam na microbiota intestinal.

Para examinar a inter-relação entre dieta, estresse, microbiota intestinal e transtornos do humor, usamos uma dieta rica em gordura (HFD) para alterar a microbiota intestinal e induzir a obesidade em camundongos e, em seguida, medimos o comportamento semelhante à ansiedade. Posteriormente, enfatizamos os camundongos usando um protocolo de estresse leve imprevisível e crônico e, mais uma vez, examinamos tanto o comportamento de ansiedade quanto a microbiota intestinal. Esses estudos demonstraram diferenças de gênero no impacto da DH e estresse sobre comportamentos semelhantes à ansiedade e atividade locomotora.

Materiais e Métodos

Animais

Ratinhos C57BL / 6 com 6 semanas de idade foram comprados na SLAC Inc. (Xangai, China). Todos os animais foram transportados ao mesmo tempo e alojados, 4 numa gaiola, na mesma sala da instalação de roedores da SFP. Os camundongos foram e foram aclimatados em um ciclo de luz / escuridão de 12 horas / 12 horas por 2 semanas com uma dieta normal contendo 10% de energia total proveniente da gordura, 70% de carboidratos e 20% de proteína (Research Diets D12450B).

New Brunswick, New Jersey, figura suplementar). Todos os animais foram transportados ao mesmo tempo e alojados na mesma sala dentro do mesmo edifício das instalações de roedores.

Com 8 semanas de idade, o peso corporal inicial foi medido e amostras fecais foram coletadas de todos os animais para análise de microbioma (dia 0, linha de base), e então metade dos camundongos fêmeas e metade dos machos foram mudados para uma dieta rica em gordura (HFD ) contendo 60% do total de energia proveniente da gordura, 20% do carboidrato e 20% da proteína (Research Dietets D12492).

Os animais permaneceram nas mesmas dietas durante a duração do estudo. O peso corporal foi medido semanalmente. Amostras fecais foram coletadas para análise de microbiota no dia 81 (após as primeiras 12 semanas em DH) e no dia 136 (após estresse). Durante os dias 85-91 e 131-136, os ratos foram sujeitos a testes comportamentais como descrito abaixo. Durante os dias 113-130, os ratos foram submetidos a estresse leve crônico imprevisível como descrito abaixo. Todas as operações e métodos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Escola de Ciências da Vida e Biotecnologia da Universidade Shanghai Jiao Tong (No. 2014–005), e realizados de acordo com suas diretrizes.

Teste comportamental

Os animais foram levados para a sala de testes comportamentais pelo menos uma hora antes do início do teste para aclimatação. A ordem do teste alternou entre os grupos para controlar qualquer efeito específico do horário do dia. Todos os testes foram realizados durante o ciclo de luz dos animais.

Teste de campo aberto

Os ratos foram colocados no centro de uma arena quadrada de campo aberto, 80 cm × 80 cm × 25 cm, e permitiram explorar por 5 min. Os movimentos foram gravados digitalmente, e depois rastreados e analisados ​​usando o software de rastreamento de vídeo ANY-maze (Stoelting Co., Wood Dale, Illinois). A arena foi dividida em uma grade de 4 × 4, e a porcentagem da distância total percorrida nos quatro quadrados centrais da grade (25% da arena) foi quantificada. A diminuição da distância percorrida na porção central da arena foi interpretada como um aumento do comportamento semelhante à ansiedade.

Labirinto mais elevado

Os ratos foram colocados no centro do labirinto em cruz elevado, de frente para um braço aberto, e foram autorizados a explorar o labirinto durante 5 min. Os movimentos foram gravados digitalmente, rastreados e analisados ​​usando o software de aplicação Mobiledatum Animal Behavior Analysis System v2.0. O tempo gasto nos braços abertos e a porcentagem de entradas de braço em braços abertos foram medidos, e a diminuição do tempo gasto em braços abertos ou diminuição de entradas em braços abertos foi interpretada como um aumento do comportamento semelhante à ansiedade 23 . A distância total percorrida e o número de entradas em todos os braços também foram quantificados como medidas de locomoção.

Outros testes comportamentais

Os camundongos também foram submetidos ao teste de nado forçado e suspensão na tentativa de medir o comportamento de desespero / depressão, mas estes testes foram inconclusivos devido ao comportamento de subida na cauda no teste de suspensão da cauda e diminuição da qualidade da pele no DFA. alimentados com leite, o que diminuiu a flutuabilidade no teste de nado forçado. Esses testes, no entanto, contribuem com estresse adicional para os camundongos, estendendo o período de estresse causado pelo protocolo de estresse leve crônico imprevisível. A ordem de teste foi o teste de campo aberto, labirinto em cruz elevado, teste de natação forçada, teste de suspensão da cauda.

Estresse leve imprevisível crônico

Os ratos foram submetidos a estresse leve crônico imprevisível por 18 dias antes do início da segunda série de testes comportamentais. Os estressores incluíram 1 ou 2 episódios por dia dos seguintes, administrados em ordem aleatória: cama úmida por 18 horas; nado forçado por 5 min em água fria (8 ° C); inclinar o animal em uma gaiola sem deitar para a frente e para trás 18 vezes a um ângulo de 45 ° em cada direção; luzes acesas durante o ciclo escuro; luzes apagadas durante o ciclo de luz; cheiros predadores; sons predadores; e forçado a nadar por 5 min em água quente (40 ° C).

Perfil de microbiota intestinal

O DNA microbiano foi extraído conforme descrito por Godon et al . 26de amostras fecais coletadas nos dias 0, 81 e 136. A região V3-V4 do gene 16S rRNA foi amplificada e bibliotecas de DNA foram preparadas de 192 amostras (n = 17 para NCD fêmeas, fêmeas HFD e HFD machos em dias 0 e 81; n = 16 para NCD machos nos dias 0 e 81; n = 15 para NCD fêmeas e HFD machos no dia 136; n = 14 para fêmeas HFD e NCD machos no dia 136) de acordo com as instruções da Illumina, e foram sequenciados usando a plataforma Illumina Miseq.

Análise de dados de sequenciamento

Ambas as extremidades direta e reversa da mesma leitura foram truncadas na primeira base, em que o valor Q não era maior do que 2. Se o par de leituras tivesse uma sobreposição mínima de 50 bp, elas seriam mescladas em uma leitura completa. Essas leituras não foram mantidas a menos que 399 pb com um erro esperado de não mais do que 0,5. Leituras com filtro de qualidade foram desreplicadas em sequências únicas e depois classificadas por diminuição da abundância, e os singletons foram descartados. Seqüências não-quiméricas representativas de OTU foram escolhidas em seguida pelo padrão Uparse. A detecçãoo de quimera baseada em referência adicional foi realizada utilizando UCHIME contra a base de dados de treino do Classificador RDP (v9). A tabela OTU foi finalizada pelo mapeamento de leituras com qualidade filtrada para as OTUs restantes com o algoritmo de alinhamento global Usearch em um corte de 97%. Seqüências representativas para cada OTU foram construídas em uma árvore filogenética por FastTree e submetidas ao classificador RDP para determinar a filogenia com um bootstrap cortado de 80% (conjunto de treinamento 16 S rRNA do banco de dados RDP 14).

As amostras foram removidas de análises adicionais se as leituras de alta qualidade das amostras fossem inferiores a 4600 (Tabela Suplementar), e então as sequências de todas as amostras fossem reduzidas para 4600 (1000 permutações) para equalizar a diferença na profundidade de seqüenciamento. Toda a análise subseqüente foi realizada com base na plataforma QIIME (versão 1.8). A diversidade alfa de cada amostra foi calculada com as OTUs observadas, a diversidade filogenética de Faith (PD Whole tree) e o índice de Shannon. A análise de coordenadas principais e a MANOVA foram realizadas com base nas distâncias Bray-Curtis.

análise estatística

Modelos de Floresta Aleatória foram introduzidos para identificar filotipos bacterianos específicos que contribuíram para a segregação da microbiota intestinal por sexo, dieta ou estresse. As amostras de todas as fêmeas e machos no Dia 0 foram utilizadas para estabelecer modelos de classificação de sexo. Os modelos de classificação de dieta ou estresse foram estabelecidos para mulheres e homens separadamente. Amostras de camundongos no NCD e HFD no Dia 0 e Dia 81 foram usadas para estabelecer modelos de classificação de dieta. Amostras de camundongos no Dia 81 e no Dia 136 em DCNT ou DH foram utilizadas para estabelecer modelos de classificação de estresse. Cada modelo Random Forest foi executado com 1.000 árvores e validação cruzada leave-one-out para um erro de generalização aprimorado. A importância de uma OTU foi determinada com base na diminuição média da precisão da discriminação.

A correlação entre as OTUs foi calculada usando o algoritmo SparCC com um procedimento de bootstrap repetido 999 vezes. O algoritmo de agrupamento de Ward e PERMANOVA (9999 permutações, P  <0,001) com base nos coeficientes de correlação de SparCC foram usados ​​para agrupar as OTUs em grupos de co-abundância (CAGs) usando o programa R.

Os pesos corporais foram analisados ​​em cada ponto de tempo usando o teste t de Student não pareado. Os resultados dos testes comportamentais foram analisados ​​quanto à significância usando ANOVA com um alfa de 0,05.

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