IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE ESPÉCIES DO GÊNERO Inga NA PLANÍCIE DE INUNDAÇÃO DO ALTO RIO PARANÁ

INTRODUÇÃO Na região noroeste do Estado do Paraná e sudeste do Mato Grosso do Sul encontra-se um importante trecho do rio Paraná, onde diversos estudos vem sendo desenvolvidos (ROMAGNOLO et al., 1994; VAZZOLER et al., 1997; SOUZA, 1998; SOUZA et al. 2004a; 2004b; SOUZA e MONTEIRO, 2005). Souza e Kita (2002), em um levantamento florístico realizado na região da planície de inundação alto Rio Paraná (PR e MS), considerando as fanerógamas, identificaram 652 espécies vegetais. As famílias de maior representatividade específica foram: Fabaceae com 38 espécies, Myrtaceae com 23, Euphorbiaceae e Rubiaceae com 22, Solanaceae com 20, Mimosaceae com 18, Poaceae com 15, Asteraceae e Sapindaceae com 14, e Rutaceae com 11 Dentro da família Mimosaceae (Leguminosae ? Mimosoideae), encontra-se a espécie Inga vera Willd, que, de acordo com Pennington (1997), tem como sinonímias Inga affins DC. e Inga uruguensis Hook. & Arn. Essa espécie possui ocorrência comum na floresta ripária do rio Paraná (SOUZA et al., 1997). Sua identificação sempre apresentou certa dificuldade por ocorrerem três espécies muito semelhantes entre si que eram Inga affins DC, Inga uruguensis Hook & Arn e Inga vera Willd. Com o trabalho de Pennington (1997), entretanto, sinonimizando dois desses nomes, essa dificuldade foi amenizada. Apesar disso, observa-se que na floresta ripária do alto rio Paraná, essa espécie possui características morfológicas diferentes entre si, como forma e o tamanho do fruto. Dessa forma, a obtenção de informações adicionais, através de técnicas de biologia molecular, em especial RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e SPAR (Single Primers Amplifications Reactions), que baseiam-se na amplificação de DNA genômico com primers curtos de seqüência aleatória, via Polymerase Chain Reaction - PCR (WILLIAMS et al., 1990), traria benefícios quanto a caracterização genotípica. Com isso poderão ou não ser detectadas diferenças relacionadas à morfologia e que durante muito tempo foram consideradas suficientes para separar três espécies diferentes (GUPTA et al., 1994; FERNANDES-MATIOLI, 1999). O estudo do gênero Inga representa uma contribuição importante para o conhecimento da flora da planície de inundação do alto rio Paraná. O conhecimento da diferenciação genética de populações deste gênero contribuirá na obtenção de informações acerca da distribuição dessas espécies nos diferentes ambientes dessa área, revelando seu habitat preferencial, além de fornecer subsídios ecológicos e informações para revegetação. Assim, objetivou-se verificar se três populações do gênero Inga (Mimosaceae) em área ripária na planície de inundação do alto rio Paraná, em Porto Rico (PR), estão geneticamente isoladas. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA A planície alagável do alto rio Paraná constitui o último trecho desse rio, livre de barragens, em território brasileiro (AGOSTINHO et al., 1995), apresentando pulsos de inundação que conferem uma dinâmica particular ao ecossistema, com flutuações anuais do nível da água que oscilam entre fases terrestre e aquática, em que a produção primária depende da composição da água e da fertilidade dos sedimentos durante a fase aquática, e da umidade do solo durante a fase terrestre (AGOSTINHO et al., 1995; JUNK, 1997; UEM.NUPÉLIA/PELD, 2000). A Planície de Inundação do Alto Rio Paraná (PIARP) apresenta diversos usos antrópicos como mineração, agricultura, pecuária, pesca e turismo. O estado de conservação da planície é espacialmente heterogêneo, obedecendo um gradiente que vai de maior alteração em áreas próximas às cidades e cada vez menores na medida em que aumenta sua distância dos centros urbanos (AGOSTINHO e ZAHWSKI, 1996). Essas áreas ripárias são reconhecidas pela Legislação Ambiental do Brasil como Áreas de Preservação Permanente pela Lei 4.771, de 15 de setembro de 1965 e, no trecho do alto rio Paraná denominado planície alagável, essas compreendem faixas de 500 m de largura e apresentam a cobertura vegetal em variados graus de perturbação (SOUZA et al., 1997). São regiões importantes na vida do homem moderno e têm sido tratadas por diversos autores (MANTOVANI, 1989; RODRIGUES, 1991; SOUZA, 1998; SOUZA, 1999; LIMA e ZAKIA, 2004). Formações florestais ripárias constituem a cobertura florestal que ocorre ao longo dos cursos de água, no ecótono ripário. Possuem elevada importância relacionada, principalmente, à biodiversidade e à manutenção do equilíbrio do ecossistema aquático (SOUZA, 1999). Entretanto, sua relação com o equilíbrio do ecossistema aquático tem causado mais impacto, pois trata, dentre outras, de questões sobre a qualidade da água pelo consumo humano (RIZZI, 1963). Diversos estudos têm sido desenvolvidos com o intuito de delinear a composição florística das florestas ripárias (VAZZOLER et al., 1997) como levantamento de flora (SOUZA et al., 1997; ROMAGNOLO et al., 1994; SOUZA, 1998; SOUZA e MONTEIRO, 2005), dinâmica na restauração natural das florestas ( SOUZA, 1998; SOUZA et al. 2004a; 2004b), fissociologia dos remanescentes florestais (SOUZA et al., 1997). Cada vez mais, no entanto, tem sido demonstrada a ocorrência de baixa similaridade entre diferentes áreas. Para a planície alagável do alto rio Paraná, Souza et al. (2004b) verificaram a ocorrência de apenas 2,8% de espécies comuns e de 55,2% exclusivas de apenas um dos nove remanescentes analisados por métodos fitossociológicos. Rodrigues e Nave (2000) encontraram resultado semelhante ao analisarem 43 levantamentos realizados no Brasil extra-amazônico. A vegetação da planície é composta por 652 espécies de fanerógamas identificadas (SOUZA et al.1997; SOUZA e KITA, 2002), sobressaindo-se as herbáceas. Estas colonizam amplos campos naturais que dominam a paisagem do site. Nesses campos, predominam as gramíneas (Panicum prionitis, P. mertensii, P. maximum), cyperaceas (Cyperus digitatus, C. difusus) e amarantáceas (Pfaffia glomerata). Entre as formas arbustivas mais comuns estão Senna pendula, Aeschynomene sp. e Sapuim bigladulatum e, entre as arbóreas isoladas, Inga uruguensis e Croton urucurana. Na mata ripariana, consideravelmente alterada pela ação antrópica e por cheias catastróficas, predominam Cecropia pachystachya, Croton urucurana, Lonchocarpus guilliminianus, L. muhelbergianus (SOUZA- STEVAUX, dados não publicados). Entre as técnicas que foram utilizadas e que permitiram a obtenção de dados sobre a identidade e o fluxo gênico das espécies do gênero Inga estão os marcadores moleculares nucleares RAPD e SPAR Técnicas de biologia molecular têm sido ferramentas úteis para o estudo da variabilidade genética em populações naturais. Pode-se amostrar as características genômicas e aumentar substancialmente a capacidade de descoberta e resolução de complexos de espécies aparentadas, além de permitir revelar casos de polimorfismo ou plasticidade dentro de um táxon (SIMISON e LINDERG, 1999). Nas últimas décadas, um número cada vez maior de marcadores moleculares vem sendo aplicado para análises de problemas relacionados à genética de populações e à sistemática. Os marcadores de DNA são vantajosos para a caracterização de recursos genéticos porque representam somente a variabilidade genética, não estando, portanto, sujeitos a influências ambientais (SODRÉ et al., 2002). A natureza molecular do polimorfismo RAPD não é inteiramente conhecida. Entretanto, evidências experimentais indicam que diferenças de apenas um par de bases (mutações de ponto) são suficientes para causar a não complementaridade do primer com o sítio de iniciação (priming site) e assim impedir a amplificação de um segmento (WILLIAMS et al.; 1990). Outras fontes de polimorfismo podem incluir deleções de sítios de iniciação ou inserções que colocam dois sítios de iniciação adjacentes a uma distância acima daquela que a DNA polimerase é capaz de percorrer. Assim, o polimorfismo genético detectado pelos marcadores RAPD tem natureza binária, isto é, o segmento amplificado (banda no gel) está presente ou ausente. Uma característica fundamental dos marcadores RAPD é o fato deles se comportarem como marcadores genéticos dominantes. Ao se observar uma banda RAPD no gel, não é possível distinguir se aquele segmento se originou a partir de uma ou de duas cópias da seqüência amplificada, ou seja genótipos heterozigotos não podem ser discriminados dos homozigotos. A técnica conhecida como SPAR (Single Primers Amplifications Reactions) gera marcadores moleculares efetivos em plantas e animais (GUPTA et al.,1994). A amplificação é realizada via PCR (Polymorfism Chain Reaction) e a peculiaridade da técnica é o emprego de um único primer com a seqüência repetitiva que intercala dois blocos de microssatélites. Para a aplicação da técnica SPAR não há necessidade de construção da biblioteca genômica total ou parcial do organismo de interesse e o seqüenciamento de muitos segmentos para posterior seleção. Os primers têm alcance amplo e são imediatamente aplicáveis, em princípio, a qualquer organismo. Esta técnica apresenta vantagem quando comparada ao RAPD, pois gera maior reprodutibilidade, devido ao uso de primers mais longos que os de RAPD, o qual permite o uso de temperaturas maiores de anelamento e, portanto maior estrigência (REDDY et al., 2002). MATERIAIS E MÉTODOS Foram coletadas folhas jovens de 25 espécimes, formando dois grupos diferenciados pela forma e tamanho do fruto. Após a coleta, as amostras foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e estocadas no laboratório em freezer -70, permanecendo congeladas até o processamento. A extração de DNA foi efetuada com metodologia baseada em fenol/clorofórmio. Após o término da Extração, realizou-se a quantificação de DNA em cada amostra para avaliar a concentração de DNA presente. Para isso utilizou-se três pesos (20ng, 50ng e 100ng respectivamente), provenientes de DNA do fago , o qual possui concentração conhecida. Com isso foi possível comparar o fragmento de DNA das amostras com o fragmento do fago  e inferir a concentração de DNA presente em cada amostra, por meio de eletrofoese em gel de agarose 0,8%. Os primers dos kits OPA, OPW e OPX e os microssatélites, foram testados para a seleção dos oligonucleotídeos e marcadores moleculares utilizados neste trabalho. Para as amplificações, foram utilizados os primers OPA-17, OPA-19, OPX-06, OPX-16 e os primers tetranucleotídeos (AAGC)4 e (GGAC)3T. O DNA amplificado foi fracionado em gel de agarose 1,4%, preparado com brometo de etídio, em campo elétrico 5 V.cm-1. As bandas do gel foram visualizadas e fotografadas sob luz ultravioleta. As populações de Inga foram comparadas entre si pelos padrões de bandas produzidos. RESULTADOS E CONCLUSÕES A técnica de RAPD permite investigar variações no genoma baseando-se no número e tamanho dos fragmentos amplificados. Comparando os perfis eletroforéticos fornecidos pelo marcador RAPD nos resultados preliminares, verificou-se que os dois grupos, previamente separados por variações morfológicas significativas nos frutos, produziram perfis eletroforéticos semelhantes, o que sugere tratar-se de espécies sinonímias. Como não foi possível obter um resultado satisfatório que caracterizasse e identificasse indubitavelmente as populações de Inga estudadas, seguiu-se com a utilização de uma técnica conhecida como SPAR, que gera marcadores moleculares efetivos em plantas e animais (GUPTA et al., 1994). A amplificação, assim como ocorre com o RAPD é realizada via PCR e a peculiaridade da técnica é o emprego de um único primer com a seqüência repetitiva de um microssatélite. A diferença entre as duas metodologias reside nas seqüências alvo dos iniciadores. Enquanto o RAPD utiliza primer que foi desenhado sem visar, a priori, a amplificação de determinados segmentos do genoma, a técnica SPAR amplifica a região que intercala dois blocos de microssatélites. Conseqüentemente, o resultado do SPAR pode ser interpretado como um mapeamento de microssatélites no genoma do organismo estudado. Os primers SPAR com seqüência tetranucleotídica têm se mostrado eficientes na produção de padrões polimórficos informativos intraespecíficos (GUPTA et al., 1994) e interespecífico (FERNANDES-MATIOLI, 1999). Dessa forma, a técnica de SPAR, seria importante na identificação de um ou mais fragmentos exclusivos de uma única população, revelando com isso o grau de polimorfismo molecular dos indivíduos. Caso fosse encontrado alto grau de polimorfismo, as modificações morfológicas deveriam ser em decorrência de possíveis isolamentos reprodutivos. Esse fator poderia provocar alterações genotípicas significativas indicando um possível processo de especiação. Contudo, ao comparar o padrão de bandeamento fornecido pelos primers tetranucleotídicos, evidenciou-se um baixo grau de polimorfismo entre os indivíduos, o que corrobora com as informações fornecidas pelo marcador molecular dominante RAPD supra citado, ou seja, tratar-se-ia de indivíduos da mesma espécie. Portanto, até o momento não foram encontradas evidências da ocorrência de mais de uma espécie do gênero Inga na planície de inundação do alto rio Paraná. Dessa forma, as variações morfológicas seriam devido a alterações cíclicas ambientais entre espécies que estivessem em locais com variações de insolação e sombreamentos diferenciados, bem como de composições edáficas distintas, não caracterizando em isolamento reprodutivo, já que constituir-se-ia em representantes de uma única espécie. Entretanto, para maior segurança nas conclusões, novas coletas deveriam ser realizadas para que pudessem ampliar o número de marcadores moleculares empregados nas análises. REFERÊNCIAS AGOSTINHO, A. A.; VAZOLLER, A. E. A. M.; THOMAZ, S. M. The high Paraná river basin: limnological and ichthyological aspects. In: Tundisi, J. G., Bicudo, C. M.; Matsumura T. (eds.). Limnology in Brazil. Rio de Janeiro, ABC/SBL. 1995. AGOSTINHO, A. A.; ZAHWSKI, M. A planície alagável do alto rio Paraná: importância e preservação. Maringá: EDUEM/Nupélia, 1996. 100p. FERNANDES-MATIOLI, F.M.C. Evolução e estrutura de populações no gênero Gymnotus (Pisces: Gymnotiformes). São Paulo: USP. 176 p. Tese (Doutorado Biologia/Genética) ? Instituto de Biociências. 1999. GUPTA, M.; CHYI, Y. S.; ROMERO-SEVERSON, J.; OWEN, J. L. Amplification of DNA markers from evolutionary divirse genomes using single primers fo simple-sequence repeats. Theor. Appl. Genet. 89: 998-1006. 1994. JUNK, W. J. The Central Amazon floodplain. Berlin: Springer, 1997. 525p. LIMA P. W.; ZAKIA M. J. B; Hidrologia de matas Ciliares. in: RODRIGUES, R. R. e LEITÃO FILHO, H. F. (eds.). Matas ciliares: conservação e recuperação. São Paulo, Edusp/Fapesp, 2004. MANTOVANI, W. Conceituação e fatores condicionantes. In: Barbosa, L.M. (Ed.). Anais do Simpósio sobre Mata Ciliar realizado em São Paulo, SP. Campinas: Fundação Cargill. 1989. PENNINGTON, T. D. 1997. The genus Inga. Botany. The Royal Botanic Garden, Kew, 1997. REDDY, M.P.; SARLA, N. SIDDIQ, E.A. Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding. Euphytica, 128:9-17, 2002. RIZZI, N.E. Função da floresta na manutenção da qualidade da água para o uso humano. Rev. Floresta: 54-65, 1963 RODRIGUES, R.R. Análise de um remanescente de Vegetação natural às margens do rio Passa Cinco, Ipeúna, SP. Campinas: UNICAMP. 325 p. tese (Doutorado em Biologia Vegetal) ? Universidade Estadual de Campinas. 1991. RODRIGUES, R.R.; NAVE, A.G. Heterogeneidade florística das matas ciliares. In Matas ciliares: conservação e recuperação (R.R. RODRIGUES e H.F. LEITÃO FILHO, eds.). Editora da Universidade de São Paulo, São Paulo, 2000 ROMAGNOLO, M. B.; SUZA, M. C.; FERRUCCI, M. S. Sapindaceae da planície de inundação do trecho superior do rio Paraná. Revista Unimar 16 (3): 61-81, 1994. SIMISON, W.B.; LINDERG, D.R. Morphological and molecular resolution of a putative cryptic species complex: a case study of Notoacmea fasciculares (Menke, 1851) (Gastropoda: Patellogastropoda). Journal of Molluscan Studies, London, 65:99-109, 1999.. SODRÉ, L.M.K.; ALMEIA,F.S.; CHIARI, L. Estudos sobre a variabilidade genética de peixes do rio Tibagi através de marcadores moleculares ? A Bacia do Rio Tibagi. Eds. MEDRI, M.E. et al. ? Londrina, 2002.. SOUZA, M.C. Estrutura e composição florística da vegetação de um remanescente florestal da margem esquerda do rio Paraná (Mata do Araldo, Município de Porto Rico, PR). Rio Claro: UNESP. 172 p. Tese (Doutorado em Biologia Vegetal) ? Instituto de Biociências, 1998.. SOUZA, M.C. Algumas considerações sobre vegetação ripária. Cadernos da Biodiversidade, Curitiba, v.2, n.1, p.4-10, 1999. SOUZA, M. C.; CILINSKI, J.; ROMAGNOLO, M. B. Levantamento florístico. In: VAZZOLER et al. (Eds.). A planície de inundação do alto rio Paraná: Aspectos físicos, biológicos e socioeconômicos. Maringá: EDUEM/NUPELIA, 1997. SOUZA, MC.; MONTEIRO, R., 2005. Levantamento florístico em remanescente de floresta ripária no alto rio Paraná: Mata do Araldo, Porto Rico, Paraná, Brasil. Acta Scientiarum Biological Sciences, vol. 27, no. 4, p. 405-414. SOUZA, M. C.; KITA, K. K. Formações vegetais ripárias da planície alagável do alto rio Paraná, Estados do Paraná e Mato Grosso do Sul, Brasil. In: UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ. NUPÉLIA/PELD. A planície de inundação do alto rio Paraná: SITE 6 ? PELD/CNPq. Coordenação de A. A. Agostinho, S. M. Thomaz, L. Rodrigues, L. C. Gomes. Maringá, 2002. cap. 3, p. 197?201. Relatório técnico anual (2002) PELD/CNPq. SOUZA, MC., KITA, KK., ROMAGNOLO, MB., TOMAZINI, V., ALBUQUERQUE, EC., SECORUN, AC. and MIOLA, DTB., 2004a. Riparian vegetation of the Paraná River Floodplain, Paraná and Mato Grosso do Sul States, Brazil. In AGOSTINHO, AA., RODRIGUES, L., GOMES, LC., THOMAZ, SM. and MIRANDA, LE. (Eds.). Structure and functioning of the Paraná River and its floodplain LTER ? site 6. Maringá: EDUEM. p. 233-238. SOUZA, MC., ROMAGNOLO, MB., KITA, KK., 2004b. Riparian vegetation: ecotones and plant communities. In THOMAZ, SM., AGOSTINHO, AA. and HAHN, NS. (Eds.). The Upper Paraná River and its floodplain: physical aspects, ecology and conservation. Leiden: Backhuys Pubblishers. UEM-UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ. Nupélia/PELD A planície alagável do alto rio Paraná:estrutura e processos ambientais. 2000. Disponível em: . Acesso em: 22 fev.2001. VAZZOLER, A E. A M.; AGOSTINHO, A A; HAHN. N. S. (Eds.). A planície de inundação do alto rio Paraná: Aspectos físicos, biológicos e socioeconômicos. Maringá: EDUEM-NUPELIA. WILLIAMS, J.G.K. KUBELIC, AR.; LIVAK, J.; RAFALSKI, J.A; TINGEY, S.V. DNA polymorphisms amplified by arbritary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18: 6531-6535, 1990..