COMPARAÇÃO DAS ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS RENAIS

COMPARAÇÃO DAS ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS RENAIS,DETECTADOS ATRAVÉS DAS TÉCNICAS HISTOQUÍMICA (HE)-HEMATOXILINA E EOSINA , (PAS) PERIODICO ÁCIDO –SHIFF EM RATOS WISTAR.SUMETIDOS Á TERAPIA CRÔNICA COM A GENTAMICINA E AMICACINA. Comparison of renal morphological changes detected by histochemistry (HE), hematoxylin and eosin. (PAS)-periodic acid-Schiff, animals rats). Submitted to chronic therapy with gentamicin and amikacin. ___________________________________________________________________ Deuseni de Mendonça Pimentel*; Rodrigo Fagundes Lopes de Oliveira*;Hilkea Carla de Souza Medeiros Programa de Pós-graduação de Especialista em Ciências Morfológicas Interdisciplinaridade no Ensino e Pesquisa, Universidade Federal do Rio Grande do Norte /Centro de Biociências/ Departamento de Morfologia. Professora. Dra. Aurigena Antunes de Araújo Ferreira. Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte __________________________________________________________________ * Autor para correspondência. E-mail: [email protected].*Pesquisa de trabalho experimental “Análise Morfológica ,alterações do Sistema Renal de Ratos Wistar Submetidos à Terapia Crônica por Gentamicina e amicacina”, Departamento de Biofísica e Farmacologia ,Universidade Federal do Rio grande do Norte (UFRN)Natal(RN),Brasil. RESUMO Introdução :Estudo baseado em resultados achados, realizados em pesquisas experimentais, afins de comparação das alterações nas estruturas das lesões em células renais. Os aminoglicosideios são drogas potencialmente nefrotóxicas e seu uso requerem monitorização quando admininistrada na terapia crônica da função renal. Objetivo. Avaliar, comparar as alterações histo-morfológica na função renal, sob a indução da gentamicina e amicacina. Material e Métodos: com 50 (cinquenta ) ratos machos , albinos da raça Wistar , com o peso aproximado entre 200 – 250 g dos quais foram selecionados em grupos de 10 (dez) ratos , receberam o fármaco – gentamicina e amicacina, pela via intraperitoneal.Os animais foram mantidos no Biotério do Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio G.Norte. Dos quais passarão por uma dieta “ ad libitum”,ficaram em temperatura ambiental entre 23 a 26°C . Métodos: Para análise histológicos foram utilizados os protocolos convencionais da técnica de HE e PAS. Para análises Estatísticas foram os utilizados testes preciso: GraphPad InStart , Krusksll-Wallis(pós-Dunn),ANOVA (pós-Tukey-Kramer). Resultados: os dados achados dos comparados das pesquisas experimentais, acima citada, apresentaram respostas semelhantes no G4,quanto a nefrotoxicidade visualizada nas células renais; através de microscópio óptico : lâmina basal, células mesangiais, capsular de Bowman e túbulos contorcido proximal e apoptose celular Palavra-chave: aminoglicosídeos, nefrotóxicidade, alterações na função renal gentamicina, amicacina , comparação. ABSTRACT Study results based on findings made in experiment research, same comparison of changes in the structures of the lesions in kidney cells. The aminoglicosydes are potentially nephrotoxic drugs and their use requires monitoring when administered in therapy of chronic kidney function. Objective. Assess, compare the histo-morphological changes in kideny function in the induction of gentamicin and amikacin. Methods: 50 (fifty) rats, albino rats, with the approximate weight of 200 - 250 g of which were selected in groups of ten (10) mice received the drug - gentamicin and amikacin by intraperitoneal . The animals were kept in the animals ,Department of Physiology and Pharmacology, Federal University of River Big North. Of which will go through a diet "ad libitum", were at room temperature between 23 to 26 ° C. Euthanasia for these animals were the infusion of an overdose of 2% thiopental (15 mg / kg w / weight). Methods: We studied histological protocols were used in the conventional technique of HE and PAS. For statistical analysis tests used were the need: GraphPad InStart, Krusksll-Wallis test (post-Dunn), ANOVA (post-Tukey-Kramer). Conclusion: the data found of the compared ones of the experiment research, above cited, had presented similar answers how much to the nephrotoxicity, visualized in the kidney cells; through optic microscope: basal blade, mesanger cells, to capsule an next, Bowman´s and tubules twisted and apoptosis, in groups 4, under the administration of the gentamicin and amikacin, in 3ª and 4ª week. WORDS KEYS: aminoglycosides, nephrotoxicity, changes in kidney function gentamicin,amikacin,comparison. 1- INTRODUÇÃO . Os antibióticos aminoglicosídeos são parte importante do arsenal terapêutico antibacteriano desde seu descobrimento, na década de 40. Os estudos que culminaram com o descobrimento desta nova classe de antibióticos iniciaram-se em 1939, no Departamento de Microbiologia da Unidade de Agricultura experimental da Universidade Rutgers, de New Jersey, nos Estados Unidos. Em 1943, após examinar vários actinomicetos de solo, Waksman et al. isolaram uma cepa de Streptomyces griseus, que produzia uma substância que inibia o crescimento do bacilo da tuberculose e de diversos microorganismos Gram-positivos e Gram-negativos, e a partir daí, em 1944, a estreptomicina foi isolada.. Seguiu-se a Neomicina que apresentava melhor actividade que a Estreptomicina em bacilos aeróbios Gram negativo, mas devido à sua notável toxicidade não era seguro o seu uso sistémico. Isolada a partir de Micromonospora em 1963, a Gentamicina constituiu um progresso no tratamento de infecções causadas por bacilos, em particular as causadas pela Pseudomonas aeruginosa. A Tobramicina e a Canamicina, são dois dos aminoglicosídeos de origem natural que foram isolados da Streptomyces spp., mas apresentam menor interesse terapêutico. Seguiu-se o desenvolvimento por semi-síntese de outros aminoglicosídeos tais como Amicacina, Netilmicina e Isepamicina. (Gonzalez III, L.S., and Spencer, J.P., 1998. Aminoglycosides: A Practical Review. American Academy of Family Phisicians. Vol.58 (8): 1811-1820. O nome aminoglicosídeo se deve ao fato da molécula ser constituída por dois ou mais aminoaçúcares unidos por ligação glicosídica à hexose ou aminociclitol, que habitualmente está em posição central intracelular ou através da barreira hemato-encefálica. Sua atividade antimicrobiana ocorre principalmente em meio aeróbio e em pH alcalino, pois necessita de oxigênio para transporte ativo nas células microbianas e é mais ativo em meio alcalino do que ácido. (TAVARES W. Atheneu;2001. p.573-626 ). Mecanismo de ação dos Aminoglicosideos Os aminoglicosídeos ligam-se a alvos na sub-unidade 30S ribossomal (16S rRNA), induzindo uma leitura errada da mensagem codificada no mRNA. Em ensaios in vitro, de síntese proteica, usando uma cadeia de mRNA, poliU e três aminoácidos, é possível que os aminoglicosídeos-aminociclitois modifiquem a incorporação dos aminoácidosA proteína anómala integra-se na membrana celular (MC) bacteriana, alterando-lhe a sua permeabilidade, o que justifica o seu mecanismo bactericida. (Sousa, JOÃO CARLOS; Antibióticos bacterianos; Publicações Farmácia Portuguesa, 2001). Todos os aminoglicosídeos agem pelo mesmo mecanismo da ação, exercendo seu efeito bactericida ao se ligarem ao ribossomo bacteriano. Desta forma, é necessário que penetrem no interior da célula bacteriana para que possam agir. Isto ocorre por meio da interação do aminoglicosídeo com a superfície celular, o seu transporte por meio da membrana e, finalmente, o acoplamento com o ribossomo.A interação com a superfície celular ocorre de maneira passiva e sem gasto de energia. Quando o aminoglicosídeo se liga a estruturas carregadas negativamente na parede celular, ele competitivamente desloca Ca 2+ e Mg 2+, que mantêm a união entre as células, formando-se "buracos" na parede celular e alterando a permeabilidade da mesma. Uma vez no interior da célula, os aminoglicosídeos se ligam à subunidade 30S do ribossomo, diminuindo a síntese proteica e levando à leitura incorreta do RNA mensageiro, causando alteração no funcionamento da membrana celular com saída de constituintes essenciais ao funcionamento da célula, provocando a morte celular. 2. PARTE EXPERIMENTAL 2.1. MATERIAL E MÉTODOS O estudo foi realizado para fase de experimentos, com 50 (cinqüenta ratoso) ratos machos, albinos da raça Wistar, com o peso aproximado entre 200 – 250 g.Foram selecionados em grupos experimentais de 10 (dez) ratos, dos quais receberam o fármaco – gentamicina ou amicacina pela via intraperitoneal .Os animais foram mantidos no Biotério do Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio G. Norte. Dos quais passarão por uma dieta “ad libitum”, ficaram em temperatura ambiental entre 23 e 26°C. Obedecendo ao ciclo circadiano de 24 horas todos os animais, uma semana antes do experimento, receberão solução salina, que é veículo da gentamicina 9 (5 mg/kg/dia) ou amicacina (15mg/kg/dia) administrado pela via intraperitoneal (i.p.). A eutanásia para esses animais será a infusão da superdosagem de Tiopental a 2% (15mg/kg). 2.2. Grupos Experimentais Quarenta e cinco ratos foram divididos aleatoriamente em 9 grupos experimentais de cinco animais que cada um recebeu a gentamicina e amicacina pela via i.p. The control group was treated with saline for 28 days. O grupo controle foi tratado com solução salina por 28 dias. Groups I, II, III and IV were injected intaperitoneally with gentamicin for 7, 14, 21 and 28 days respectively. Grupos I, II, III e IV foram tratados com gentamicina para 7, 14, 21 e 28 dias respectivamente. After treatment, the animals in all groups were sacrificed and the kidneys were quicky removed, decapsulated and divided longitudinally into two equally sized pieces. Grupos V, VI, VII e VIII foram tratados com amicacina por 7, 14, 21 e 28 dias respectivamente Após o tratamento, os animais em todos os grupos foram sacrificados e os rins foram removidos pelo método de Quicky,. One piece was placed in formaldehyde solution to be embedded in parafine. Uma peça foi colocada em solução de formaldeído a ser incorporados em parafina. 5 μm-thick sections were cut for histopathologic examination, by light microscopy. 5 μm de espessura-secções foram cortadas para exame histopatológico, por microscopia de luz. 3. TÉCNICA HISTOLÓGICA As técnicas de colorações histológicas já eram utilizadas desde o início do século XVIII, neste caso, empregando o corante Açafrão. Porém, foi só a partir do século XIX que a coloração de células passou a ser mais empregada. Atualmente, foram desenvolvidos diferentes corantes para os diferentes componentes das células e dos tecidos. (GARTNER & HIATT, 1999; GENESER, 2003; SALAS et al., 2004). Os corantes podem ser agrupados em três classes: corantes que coram os componentes ácidos e básicos da célula; corantes especializados e os sais metálicos. Na coloração histológicos corantes mais utilizados são a hematoxilina (corante básico) e a eosina (corante ácido), onde o corante básico reage com os componentes ácidos do núcleo e o corante ácido reage com os componentes básicos citoplasmático,corando-os ,( MAIA,V. 1979 ). 3.1 .Técnica Histoquímica (HE) - Hematoxilina e Eosina A técnica de Histoquímica por coloração com hematoxilina-eosina (HE) inicia-se após a amostra já ter passado pelas etapas de desitratação, feito mantendo amostra mergulhada sequencialmente em álcool etílico 70%,80%,90% e 110% de diafanização ,(Clareamento) em xilol e da impregnação em parafina. A amostra dentro da parafina é então, cortada pelo micrótomo em finas camadas de 5u. Por fim, realiza-se os processos de coloração em HE e de preparação da lâmina histológica para que possa ser observada microscopia de luz. Através dessa técnica, podemos diferenciar porções basófilas e acidófilas do tecido estudado. A hematoxilina é um corante básico, e de efeito coloração em estruturas básicas. Sendo assim, ela costuma corar os núcleos e o retículo endoplasmático rugoso, locais onde há grande quantidade de proteínas (básicas pelo seu agrupamento amina). A eosina é um corante ácido com grandes afinidades por citoplasma de células ricas em mitocôndrias, fibras colágenas e outras substâncias ácidas das células. (SIGMA-ALDRICH -2003 )] 3.2 Técnica histoquímica PAS (Período Ácid-Schiff) A técnica de Histoquímica por PAS (ácido periódico – Schiff) tem seu uso reservado ao diagnóstico in vitro, sendo útil para a detecção de polissacarídeos e oligossacarídeos. O processo de coloração das seções de tecido se baseia, inicialmente, na transformação de radicais 1,2-glicol presentes nos açúcares em resíduos de aldeído, por meio da oxidação promovida pelo ácido periódico. Em seguida, estes resíduos de aldeído são revelados pelo reagente de Schiff (uma mistura de pararrosanilina e metabissulfito de sódio), que ao reagir produz uma cor de rosa a vermelho. Dessa forma, nos locais de corte onde há polissacarídeos a coloração ocorrerá, permitindo uma visualização detalhada, através do microscópio, das estruturas celulares positivas o PAS, como a membrana basal subjacente aos epitélios e os mucopolissacarídeos presentes em distintas células e tecidos. Isto torna possível a observação de alterações histológicas nos tecidos, o que é um dos objetivos desta técnica. ( SIGMA-ALDRICH -2003 ). 4. DETERMINAÇÃO DOS ESCORES HISTOLÓGICOS Os néfrons de cada rim extraído foram visualizados, por microscopia óptica, a fim de se qualificar as características histológicas encontradas, classificando-se de 1 a 4 o nível de alteração, desde inalterado até severo, conforme demonstrado na tabela 1. A determinação de uma pontuação, ou escores, que representasse o grau de danos nos rins foi validada para evitar interpretações distintas com relação às características encontradas nas lâminas contendo as amostras renais. 4.1. Tabela 1. Características histológicas definidas por escore Características Histológicas1 (inalterado)2 (leve)3 (moderado)4 (severo) Células parietais da cápsula – HE e PASCaracterísticas normaisMorfologia nor-mal; coloração levemente alte-radaMorfologia normal; coloração moderamente alteradaMorfologia nor-mal; coloração e números alterados Capilares glome-rulares– PAS Características normais Descontinuida-de leve da lâmi-na basalDescontinuida-de moderada da lâmina ba-salDescontinuidade intensa da lâmina basal Célula mesangial – PASCaracterísticas normais Acidofilia leve da célula mesangialAcidofilia moderada e discreto aumento no número de células mesangiais Acidofilia intensa; aumento no número de células mesangi-ais e diminuição do espaço capsular Túbulo contorcido proximal– PAS Características normais Borda em escova íntegra e discreta descontinuidade da lâmina basal Borda em escova e lâmina basal descon-tínuasBorda em es-cova ausente; lâmina basal descontínua e apoptose das células tubula-res Cada lâmina observada continha material de apenas um rato, tendo recebido um valor de escore para as características referentes às seguintes estruturas: células parietais da cápsula, capilares glomerulares, células mesangiais e túbulo contorcido proximal. Assim, em todos os grupos, para cada um dos cinco ratos obteve-se quatro escores correspondentes a análise destas estruturas, totalizando 20 escores por grupo. 5. ANÁLISE ESTATÍSTICA As alterações renais foram analisadas qualitativamente pelo programa estatístico GraphPad InStart. Para a análise das características histológicas utilizando-se os escores foi feito o teste de Kruskal-Wallis, seguido do pós-teste Dunn de comparações múltiplas, com nível de significância de 5%. 6. RESULTADOS Figura 1. Comparação morfológica entre Grupo Controle (gp controle), grupos Experimentais da Amikacina (AK) e grupos experimentias gentamicina(gt). Gp Controle X AK gp 1X GT gp 1 (P > 0.05), gp Controle X AK gp 1 e GT gp 1(P > 0.05), AK gp 1 X GT gp 3 e GT gp 4 (P< 0.0001), AK gp 2 X AK gp 4 (P< 0.0001), AK gp 2 X GT gp 4 (P< 0.0001), AK gp 3 X. GT gp1(P< 0.0001), AK Grupo 4 vs. GT gp1 e GT gp 2 (P< 0.0001), AK gp 3 X GT gp 4 (P< 0.0001). Em relação ao grupo controle foram verificadas alterações histológicas estatisticamente significante tanto para gentamicina, quanto para amicacina (p<0.05) observada a partir dos grupos tratados na segunda semana. Entre os grupos tratados com amicacina apenas não correu diferença estatisticamente significante entre grupo 2 e 3 ( p>0,05). No grupo tratado com gentamicina não foram observadas diferença significante entre os grupos 1 e 2, grupos 2 e 3 , e grupos 3 e 4 (p>0,05). A comparação estatística entre os grupos tratados com gentamicina e amicacina apresentou extrema significância (p<0.0001). Os grupos tratados que contribuíram para as diferenças encontradas foram entre o grupo 1 (amicacina/gentamicina) com grupos 3 e 4 (amicacina/gentamicina). Entre grupo 2 (amicacina/gentamicina) amicacina e grupo 4(amicacina/gentamicina). O grupo 4 amicacina/gentamicina) com o grupo 2 (amicacina/gentamicina). 6.1 Caracteristicas das alterações renais morfohistológica, visualizada pela microscopia luz, através da Técnica Ácido Periódico Schiff (PAS). Figura 1- Grupo controle: Morfologia Glomérulos e túbulos renais normais ( HE-PAS) Gentamicina e Amicacina. Túbulo contorcido proximal Glomérulo Nesta lâmina, Pode-se observar a membrana basal que reveste os túbulos renais e os glomérulos. Essa membrana é formada pela associação da lâmina basal e a sua camada subjacente, composta por fibras reticulares, proteínas e glicoproteínas.A lamina basal é formada por colágeno tipo IV,uma glicoproteína chamada laminina e proteoglicanas cuja síntese ocorre nas células epiteliais. 6.2.Caracteristicas morfológica nas estruturas das alterações renais Ácido Periódico Schiff - PAS : . Figura 2- Grupo 4 - Amicacina Ruptura do Glomérular. Capilares glomerulares descontinuidade intensa da lâmina basal Túbulo contorcido proximal ,borda em escova ausente,lâmina basal,apoptose das células tubulares. Figura 3- Grupo 4 - Gentamicina Ruptura do Glomérular. Capilares glomerulares descontinuidade intensa da lâmina basal ↓ Túbulo contorcido proximal ,borda em escova ausente,lâmina basal,apoptose das células tubulares. Nas lâminas das figuras 3 e 4, foram visualizadas , capilares glomerulares :descontinuidade intensa da lâmina basal.Células mesangiais: acidofilia intensa;aumento no número de células mesangiais e diminuição do espaço capsular .Nos túbulos contorcido proximal:borda em escova ausente;lâmina basal descontinua e apoptose das células tubulares Obs. rim esbranquiçado em animais do Grupo 4, gentamicina. 7. DISCUSSÃO Dados da Literatura relatam que a terapêutica com aminoglicosídeos deveria ser baseado em esquema alternado, ou seja, a administração do antibiótico deveria ser mantida a cada 48 horas (MALLER e colab.,1988;GILBERT,1991).Através de estudos de investigação,realizados em humanos (prospectivos e randomizados ),dos quais foram determinadas doses clínicas para netilmicina, tobramicina , amicacina e gentamicina.A amicacina demonstrou menor acometimento lisossomal e menor atividade nas enzimas fosfolipidicas ,o que permitiu aos pesquisadores inferirem que a amicacina pudesse ser o aminoglicosídeos menos tóxico quanto comparada a gentamicina, tobramicina e netilmicina ( DE BROE e colab.;1983; DE BROE e colab.;1984 ). Os dados encontrados no estudo realizado comparando a gentamicina com a amicacina, foram Segundo os cálculos estatísticos de Kruskall-Wallis ,com pós-teste de Dunn.Os teste avaliou que em relação aos danos em nível histológico,houve significância ( P < 0.0001 ).Evidendeciando a presença de alterações histológicas renais, nos casos comparados os escores obtidos aos grupos controle da amicacina e gentamicina. Quando foram comparados o grupo controle em relação aos grupos tratados com gentamicina e amicacina no período de 01 a 04 semanas. Pode-se observar que as diferenças existiram no grupo controle mais significantemente no grupo 2 da amicacina, quando comparado com grupo 2 da gentamicina. No entanto a partir da 03 e 04 semana as diferenças foram semelhantes para ambos os grupos em relação ao controle. Quando comparados os grupos tratados com gentamicina e amicacina os efeitos mais graves foram observados nas 03 e 04 semanas. Foram observados Onde se observou com mais detalhes as estruturas celulares, a parte externa do rim esbranquiçado, presença de anormalidade típicas de um efeito nefrotóxico , Tais alterações consistem na contração glomerular e das células mesangiais, no aumento da proliferação celular, principalmente entre as mesangiais, e na necrose celular.,a destruição da membrana basal. Pelo os dados que se foi observado. Os grupos G4 (amicacina –gentamicina) passou pelo processo de indução desses aminoglicosideos no período de 4 semanas . E os grupos 1 , por uma semana . Dessa forma, o tempo de exposição dos fármacos está diretamente ligado ao grau da sua nefrotoxicidade. O efeito tóxico observado nas amostras renais, especialmente no grupo 4. Este processo envolve, em seu mecanismo, a ação de organelas como os lisossomos e as mitocôndrias, através da ativação de sensores específicos de estresse celular. De acordo com ( HANSLIK et al;1994). O acúmulo do fármaco gentamicina e/ou amicacina no interior dos lisossomos poderia resultar na ruptura de sua membrana e, em seguida, na liberação das hidrolases, as quais contribuem para a apoptose e necrose celular. Em estudos morfológicos têm demonstrado que os lisossomos são as primeiras organelas a mostrarem alterações durante o tratamento dos aminoglicosídeos ( De BROE e colab.,1984). 8. CONCLUSÃO De acordo com os resultados obtidos pela avaliação e/ou comparação da gentamicina e amicacina, onde o grupo 4 foi observado o nível das alterações estruturais renais mais severas,pode-se afirmar que existe uma associação entre o nível de toxicidade e o tempo pelo qual os aminoglicosídeos foram administrados, observando-se uma relação diretamente proporcional, o que indica que o uso desses fármacos devem ser monitorizados, por trazer comprometimento na função renal. Para alguns autores seria prudente iniciar esta monotorização após a terceira dose de administração do aminoglicosídeo,desta forma ajustes e/ou correções de dosagens poderiam ser requeridas (DE BROE e colab.,1989 ). REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1- De BROE,M.E.;PAULUS,GJ.;VERPOOTEN,G.A.;TULKENS,P.M. In.nephrotoxicity 0f aminoglicosídeos .‘’Proceedings of the 13 th International Congresso of Chemotherapy. “ Karres. R .; ed., vol. 86, n.l, p.11-86,1983. 2- DeBROE,M.E.;PAULUS,GJ.;VERPOOTEN,G.A.;ROELS,F.;BUYSSENS.N.;WEDEEN, R.P .Early offects of gentamicin,tobramicin,an amikacin on the human kidney.Kidney Int., v.25, n.4, p. 643-52 , 1984. 3- De BROE,M.E. GIULIANO, R.A.; VERPOOTEN, G.A. Aminoglycoside nephrotoxicity : mechanism and prevention. Adv.Exp.Med.Biol., v.252, n.5, p.233-45,1989. 4- DOS SANTOS OF, BOIM MA, BARROS EJ, SCHOR N. ROLE of platelet activating factor in gentamicin and cisplatin nephrotoxicity. Kidney. http://www.scielo.br/scielo. 5- CALLEGARI-JACQUES, Sidia M. 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