ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DO CHÁ DE GUACO

1. INTRODUÇÂO A evolução do homem está intimamente ligada ao uso de plantas medicinais na terapêutica, onde dados apontam que os homens de Neanderthal já as utilizavam quando se deparavam com algum malefício, valendo-se de suas próprias experiências e da observação do uso de plantas pelos animais (OLIVEIRA; SIMÕES; SASSI, 2005). Consideradas fator de suma importância para a manutenção das condições da saúde das pessoas, a Fitoterapia é parte importante da cultura de um povo, sendo o conhecimento utilizado e difundido pelas populações por várias gerações (TOMAZZONI; NEGRELLE; CENTA, 2006). A Fitoterapia tem como conceito o uso de plantas ou suas partes com finalidade terapêutica (OLIVEIRA; SIMÕES; SASSI, 2005). Entre as plantas medicinais de uso popular está o guaco, Mikania glomerata spreng, conhecido popularmente como erva-das-serpentes, um arbusto lenhoso de perfume intenso e inconfundível que habita a Mata Atlântica litorânea. É comprovadamente eficaz na dilatação dos brônquios, porém os mecanismos de ação não foram totalmente compreendidos (BARATTO, 2008), sendo indicado para gripes e resfriados, bronquites alérgica e infecciosa como expectorante. Existe, no entanto, uma precaução em relação aos hemofílicos, pois a planta possui um composto que pode causar hemorragias, alterando a coagulação sanguínea. Em doses altas pode causar vômitos e diarréia, outro motivo de cautela no uso deste chá. A recomendação é tomar 1 xícara de chá, feito com suas folhas, três vezes ao dia (ANVISA, 2010; VARELLA, 2010). A Resolução da Diretoria Colegiada da ANVISA (RDC) n° 10, de 2010, que dispõe sobre a notificação de drogas vegetais- plantas medicinais ou suas partes, que contenham as substâncias ou classes de substâncias, responsáveis pela ação terapêutica, após processos de coleta ou colheita, estabilização, secagem, podendo ser íntegra, rasurada ou triturada- traz regras específicas para a comercialização das mesmas. O fabricante deve garantir a integridade de seu produto, a começar pela embalagem, a qual necessita proteger a droga vegetal de qualquer contaminação e efeitos da luz e umidade. Deve apresentar também, o lacre de segurança, que garante um produto inviolado e na embalagem todas as informações necessárias para o consumidor, a fim de se evitar enganos. Incluí-se nestas informações o nome comercial e nomenclatura botânica, nome do responsável pelo produto, fabricante, lote, data de fabricação, prazo de validade, entre outros. O chá de guaco, segundo a RDC 10/10, deve ser preparado pelo método de infusão, técnica extrativa onde se verte água fervente sobre a planta, tampa-se ou abafa-se o recipiente por um período de tempo indeterminado, para evitar que estas percam suas propriedades medicinais. É um método indicado para folhas (frescas ou secas), flores reduzidas normalmente a pó ou rasuradas, plantas tenras (ANVISA, 2010; FERRO, 2006). Segundo a mesma resolução deve-se utilizar 3 g da folha para 150 mL de água. Os princípios ativos que constituem o chá podem se transformar em substâncias prejudiciais à saúde, por meio de reações químicas, após 24 horas do preparo. Desta forma é indicado que seu consumo seja feito em no máximo 24 horas (REIA, 2009). Como são determinados como produto a serem consumidos após a adição de líquido com emprego de calor (mínimo 75ºC por 20 segundos), os chás possuem grande probabilidade de contaminação microbiana, revelando que o manuseio de plantas medicinais deve ser feito com grandes cuidados. Entre os principais microorganismos patogênicos encontrados em vegetais estão Salmonella sp e Escherichia coli, ambos coligados à contaminação fecal, estas contaminações estão geralmente ligados ao armazenamento, modo de preparo e conservação inadequada dos chás (GOMES; NEGRELLE; ELPO, 2008). Subdivididas em duas grandes categorias, as doenças microbianas de procedência alimentar, podem ser classificadas como infecções alimentares e intoxicações alimentares. As bactérias Grampositivas, Gram negativas, fungos e vírus são conhecidos como os principais microorganismos patogênicos de interesse em contaminações e toxiinfecções alimentares (FRANCO; LANDGRAF, 2005). Entende-se por infecção alimentar a doença causada por bactérias capazes de desenvolverem-se no interior do trato gastrointestinal podendo invadir os tecidos ou os fluídos orgânicos do hospedeiro, ou de produzir toxinas (enterotoxinas). Os principais e comuns sintomas caracterizam-se pelo aparecimento de dores abdominais, diarréia, febre e náuseas que, normalmente, aparecem de 6 a 48 horas após a ingestão do alimento contaminado (FIGUEIREDO, 2002). Entre os meios de cultura utilizados para análise microbiológica estão o Ágar Nutriente, Ágar Sabouraud e Ágar MacConkey. O meio Ágar Nutriente é muito utilizado nos procedimentos de laboratórios de microbiologia, por ser um meio relativamente simples, barato e fácil de ser preparado, podendo ser empregado na análise de água, alimentos e leite. É usado para observação de desenvolvimento de espécies de bacilos Gram positivos, com comprovado crescimento bom a excelente de Escherichia coli e Streptococcus pneumoniae. Por ser um meio nutritivo, não ocorre ausência de crescimento de microorganismos. O meio Ágar Sabouraud favorece o crescimento de diversos fungos leves filamentosos e duriformes, sendo considerado de bom à excelente para Candida albicans e Aspergillus Níger. O meio Ágar MacConkey inibe o crescimento de microorganismos gram-positivos, principalmente enterococos e estafilococos, ou seja, não há crescimento de bactérias Gram positivas neste meio. Não é um meio tão seletivo para bactérias gram-negativas, mas ainda assim é utilizado para isolar este tipo de bacilo (enterobactérias e não fermentadores), sendo positivo para crescimento de especialmente Proteus mirabilis e Escherichia coli (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2004a). 2. OBJETIVO Este trabalho teve como objetivo a avaliação microbiológica do chá de guaco, com e sem açúcar, no dia, 24 e 48 horas, após o seu preparo, a fim de se verificar possíveis contaminações. 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Obtenção das Amostras A planta medicinal Mikania glomerata spreng (lote CER.CHA.005, cultivada em Guarapuava (PR) pelo fabricante Cercopa) popularmente conhecida como "guaco" foi adquirida em um estabelecimento comercial de plantas medicinais na cidade de Santo André no Estado de São Paulo. Como critério de escolha do estabelecimento, considerou-se as condições higiênico-sanitárias dos locais. 3.2 Preparo das Amostras O chá foi preparado pelo método de infusão (ANVISA, 2010). Colocou-se 150 mL de água potável fervente sobre 3 g (1colher de chá) de folha em um recipiente adequado e esterilizado, abafou-se por 15 minutos e coou-se. Em uma amostra, denominada amostra B, adicionou-se 8 g de açúcar da marca União. Após o preparo, as amostras foram acondicionadas em pote estéril fechado, temperatura ambiente, para que qualquer contaminação externa fosse evitada. 3.3 Cultivo em Placas ? Meios de Cultura Em triplicata, as amostras de chá de guaco foram inoculadas em placas com meio de Ágar Nutriente, Ágar MacConkey e Ágar Sabouraud no dia, 24 e 48 horas após o preparo. Pela técnica de semeadura quantitativa em estrias, com a alça devidamente esterilizada (flambada) em Bico de Bunsen, o chá foi semeado em todas as placas. A técnica consiste em inocular inicialmente o material a ser analisado, traçando uma linha central no meio de cultura. Após, estrias são traçadas verticalmente ao traçado inicial, em zig-zag, conforme Figura 1 (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2004c). Após a inoculação, todas as placas foram devidamente identificadas e levadas à estufa, onde permaneceram por até 48 horas (TAVEIRA et al, 2008). Figura 1: Técnica de Semeadura Quantitativa em Estrias Fonte: AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2004c. 3.4 Análise das Placas As placas foram observadas após 24 horas na estufa. Em caso de crescimento, as mesmas foram retiradas da mesma e os microorganismos isolados em lâmina, para análise em microscópio. Em seguida, as mesmas foram levadas à refrigeração em geladeira (a fim de inibir mais crescimento). As placas que apresentaram pouco ou nenhum crescimento retornaram à estufa, a fim de que o mesmo fosse favorecido e contribuísse para o isolamento em lâminas. Após 48 horas, em caso de crescimento, isolaram-se os microorganismos existentes e prepararam-se as lâminas. Meios de cultura sem crescimento de microorganismos foram descartados em lixo contaminado. 3.5 Preparação de lâminas - Coloração de Gram Para a preparação das lâminas foram utilizados os microorganismos que cresceram nas placas com meios de cultura. Foram isoladas com a alça devidamente esterilizada em Bico de Bunsen, as colônias de bactérias que estavam mais espalhadas no meio de cultura, para facilitar a posterior visualização em lâmina no microscópio. Pegou-se então, uma parte da colônia escolhida com a ponta da alça, retirando da placa o suficiente para análise, com o cuidado para não retirar conteúdo do próprio meio de cultura e colocou-se na lâmina. Homogeneizou-se com uma gota de água o conteúdo capturado com a alça, esfregando levemente a mesma até a completa homogeneização do esfregaço. Procedeu-se a secagem da lâmina por aproximação ao Bico de Bunsen. As lâminas contendo esfregaço seco foram organizadas sobre a pia, apoiadas em trilhos, para aplicação da técnica de Coloração de Gram: 1. Violeta de Genciana cobrindo toda a extensão do esfregaço, durante 1 minuto (identificação de bactérias gram-negativas- azuis a roxas); 2. Enxágue em filete de água corrente; 3. Cobertura com lugol (fixação do corante); 4. Enxágue em filete de água corrente; 5. Álcool 70% (degradação da camada peptideoglicana das bactérias que as possuem); 6. Enxágue em filete de água corrente; 7. Corante Fucsina, durante 30 segundos (identificador de bactérias Gram positivas (vermelhas a rosas). 8. Enxágue em filete de água corrente; 9. Secagem ao ar livre. Depois de secas, as lâminas foram analisadas em microscópio. 4. RESULTADOS Com a inoculação do chá imediatamente após o preparo foram observados crescimento de pequenas quantidades de colônias, tanto em meio Ágar Sabouraud, quanto em meio Nutriente, consideradas insignificantes para o estudo, pois o crescimento pode estar relacionado com a contaminação do ambiente ou de algum outro fator, como contaminação do meio, acondicionamento, entre outros. Nas inoculações após 24 e 48 horas, foram observados crescimento de microorganismos nas placas. Nas placas de Ágar MacConkey não se observaram crescimento de microorganismos de nenhuma amostra (após, 24 h e 48 h do preparo). Nas amostras de chá 24 horas e 48 horas após o preparo (sem e com adição de açúcar) foram encontradas bactérias Gram negativas e Gram positivas. De acordo com a morfologia e classificação das bactérias, observaram-se bacilos Gram negativos, fileiras Gram negativos e Gram positivos, cocos Gram positivos e Gram negativos e vibriões Gram positivos, como demonstrado na Tabela 1 e Tabela 2. As amostras de chá inoculadas após 24 horas, 48 horas do preparo e com adição de açúcar não apresentaram aspectos diferenciados. Agar Nutriente Agar Sabouraud Agar MacConkey Bacilos Gram + Presente Ausente Ausente Bacilos Gram - Ausente Ausente Ausente Cocos Gram + Presente Presente Ausente Cocos Gram - Presente Ausente Ausente Fileiras Gram + Presente Presente Ausente Fileiras Gram- Presente Presente Ausente Vibrião Gram + Presente Presente Ausente Vibrião Gram - Ausente Ausente Ausente Tabela 1. Representação de presença ou ausência dos microorganismos encontrados nas placas com seus respectivos meios de Cultura, de amostras de chá 24 horas após seu preparo. Agar Nutriente Agar Sabouraud Agar MacConkey Bacilos Gram + Presente Ausente Ausente Bacilos Gram - Ausente Ausente Ausente Cocos Gram + Presente Presente Ausente Cocos Gram - Presente Ausente Ausente Fileiras Gram + Presente Presente Ausente Fileiras Gram- Presente Presente Ausente Vibrião Gram + Presente Presente Ausente Vibrião Gram - Ausente Ausente Ausente Tabela 2. Representação de presença ou ausência dos microorganismos encontrados nas placas com seus respectivos meios de Cultura, de amostras de chá 48 horas após seu preparo. 5. DISCUSSÃO A utilização de chás é uma prática bastante comum, inclusive em crianças (CÉSAR et al, 1996; FLORES, MENGUE, 2005; CARVALHAES, PARADA, COSTA 2007). Portanto, a garantia da qualidade do mesmo é uma preocupação, visto a nova legislação específica publicada (RDC 10/10) a fim de referendar a fiscali¬zação sanitária da qualidade dos mesmos no setor de comercialização. Passíveis de contaminação microbiana, os chás podem veicular vários microorganismos, patogênicos ou não. Esta contaminação pode estar associada às condições de preparo, no que se refere às questões higiênico-sanitárias, tanto quanto à contaminação prévia da matéria-prima (droga vegetal), devido ao seu mau acondicionamento, diferentes tecnologias utilizadas, teor de umidade, entre outros (GOMES; NEGRELLE; ELPO, 2008). Características da própria planta podem ser consideradas como fatores intrínsecos para contaminação. Já os fatores extrínsecos são aqueles relacionados ao local de armazenamento, modo de preparo, fatores ambientais (MELO et al, 2005). Adquirir um produto em estabelecimento seguro, idôneo são fatores essenciais para evitar alguns riscos de contaminação. Estando a droga vegetal livre de contaminação, para assegurar que o produto esteja sem contaminação após o preparo, o consumidor deve empregar temperaturas e tempo de fervuras adequadas. Alguns esporos bacterianos são muito resistentes à temperaturas extremas. Alguns podem sobreviver em condições que variam de minutos a 120ºC e horas a 100ºC (ICMSF, 1991). A resistência dos fungos à ação térmica é muito menor que aquela das bactérias, havendo, como nesta, grande variação. A contaminação microbiana de um produto pode acarretar alterações em suas propriedades físicas e químicas e ainda caracteriza risco de infecção para o usuário (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010). O Farmacêutico tem como papel a orientação do consumidor para o uso correto dos chás, desde sua aquisição até modo de preparo. Visto que a contaminação pode ser proveniente de seu uso incorreto, desrespeitando as condições higiênico-sanitárias. Pertet et al. (1988) apud Gomes, Negrelle, Elpo, (2008) registraram a ocorrência de contaminação fecal em vários alimentos de preparo quente, inclusive chás e Zhao et al. (1997) apud Gomes, Negrelle, Elpo, (2008) evidenciaram a contaminação fecal em chás gelados servidos em restaurantes americanos, incluindo bactérias como Klebsiella e Enterobacter, as quais foram atribuídas às práticas higiênicas inadequadas no manuseio após a infusão. O aspecto microbiológico merece indispensável atenção, visto que indica positividade ou não para microorganismos patogênicos, verificando a existência de riscos à saúde pública. A contaminação evidenciada nas amostras de chá 24 horas e 48 horas após o preparo (sem e com adição de açúcar) com bactérias Gram negativas e Gram positivas, podem ter como causa a água utilizada, o cultivo, manuseio, e armazenamento da planta, os utensílios utilizados (panela, colher), o próprio ambiente de preparo, entre outros fatores. As bactérias Gram positivas, mais comuns em alimentos, são os Estreptococos, Estafilococos e Enterococos. Os Estreptococos pertencem à família Streptococcaceae, que tem cocos em forma de cadeia. São classificados pelo tipo de morte celular (hemólise), tem preferência por locais oxigenados e também se desenvolvem em meio anaeróbio. Os sintomas mais comuns, após ingestão dos mesmo são: febre, vômitos e náuseas. Os Estafilococos por não apresentarem esporos (não esporulados) são os que mais resistem ao meio ambiente e ao calor, podendo sobreviver por vários meses (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2004b). Os Enterococos são anaeróbios facultativos e crescem idealmente à temperatura de 35ºC, sendo resistentes a pH até 9,6. Os sintomas aparecem entre 2 a 36 horas após o consumo desta bactéria e são dores abdominais, vômitos e náuseas (CAMARGO; DARINI, 2002). Como principais bactérias encontradas em contaminações de alimentos estão a Salmonella sp e a Escherichia coli, ambas Gram negativas e da família das Enterobacteriaceae. A Salmonella sp possui forma de bastonete e tem seu período de incubação de 16 a 72 horas, com a enfermidade durando de 2 a 7 dias. Tem como principais sintomas a dor abdominal, dor de cabeça, diarréia, vômito, náuseas, febre e fraqueza. A doença é caracterizada pela entrada no lúmen e penetração das células de Salmonella no epitélio do intestino delgado, onde se proliferam e invade o íleo e o cólon, causando uma resposta inflamatória (MACÊDO, 2007). A Escherichia coli é uma bactéria anaeróbia facultativa, metaboliza várias substâncias, como ácidos, proteínas, lipídios, carboidratos e utiliza a glicose como fonte de carboidrato. São encontradas no trato intestinal normal do homem e dos animais, com crescimento em temperatura entre 7 e 47º C. Seus sintomas principais são colites hemorrágicas caracterizadas por uma diarréia sanguinolenta, ausência de febre, dores abdominais, e aparecem entre 3 a 9 dias após o contato com o alimento contaminado (CARNEIRO, 2008). Como não se verificou crescimento no meio Agar MacConkey, concluiu-se que as amostras não estavam contaminadas por enterobactérias Gram negativas, devidas o mesmo ser um meio seletivo para estas e inibidor de crescimento de bactérias Gram positivas (BARBOSA; TORRES; FURLANETO, 2005). Apesar do chá 24 e 48 horas do preparo não apresentarem modificações nas suas características organolépticas (odor, sabor, cor) e não apresentarem crescimento de microorganismos patogênicos, pela presença de microorganismos, a ingestão após 24 horas pode vir a trazer riscos à saúde. Devido à falta de materiais disponíveis na Universidade, neste trabalho não foi feita a contagem e identificação de microorganismos. Para melhores conclusões sobre a ingestão após 24 horas, sugere-se que o estudo seja repetido com a contagem de microorganismos e unidades formadoras de colônia, para identificação e quantificação daqueles que crescerem. Sugerem-se ainda, que se avalie a qualidade físico-química do chá de guaco, com avaliação da cumarina (marcador) e a qualidade microbiológica 12 horas após o preparo. 6. CONCLUSÃO Os resultados sugerem que o chá de guaco deve ser consumido imediatamente após seu preparo, devido 24 e 48 horas de acondicionamento, com açúcar ou não, o produto ter apresentado contaminação por bactérias Gram positivas e Gram negativas, mesmo mantendo suas características organolépticas iniciais. 7. REFERÊNCIAS AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos. 2004a. Disponível em: . Acesso em 28 de abril de 2011. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Detecção e Identificação de Bactérias de Importância Médica. 2004b. Disponível em: . Acesso em 28 de abril de 2011. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Procedimentos Laboratoriais: da Requisição do Exame à Análise Microbiológica. 2204c. Disponível em: . Acesso em 13 de maio de 2011. 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