A ação das espécies ativas de oxigênio (EAO) na isquemia e reperfusão sanguinea dos orgãos.
Publicado em 08 de agosto de 2009 por EDSON COSTA
INTRODUÇÃO
Espécie ativa de oxigênio (EAO, também conhecida como radical livre de oxigênio (RLO), é qualquer espécie química capaz de existência independente, com grande poder oxi-redutivo e que contém um ou mais elétrons desemparelhados na sua camada mais externa . As EAO apresentam uma vida média muito curta e, devido à sua alta reatividade, a maioria dessas espécies químicas existe apenas em baixas concentrações (FERREIRA,2000).
As EAO podem estar envolvidas na fisiopatogenia de diferentes situações: toxidade exógena (radiação ionizante, agentes quimioterapicos, tetracloreto de carbono, paraquat, carcinógenos químicos), síndromes de hiperoxigenação (toxidade pulmonar por oxigênio hiperbárico, fibroplasia retrolental), síndromes isquêmico-reperfusionais (infarto do miocárdio, cardioplegia cirúrgica, preservação de órgãos para transplantes, isquemia cerebral, transferência de retalhos livres de pele e músculos), desordens inflamatórias (glomerulonefrites, vasculites e doenças autoimunes), choque hemorrágico, sobrecarga de ferro (hemocromatose, talassemias), deficiências nutricionais, álcool, câncer e amiloidose, entre outros . Doenças dos sistemas sanguíneo, respiratório, cardiovascular, urinário, gastrintestinal, nervoso central, visual e cutâneo têm sido referidas como tendo associação ou mediação por EAO (LEHNINGER, 1999).
Assim, o objetivo desta revisão é apresentar aspectos gerais sobre as EAO, salientando o envolvimento de tais espécies químicas no dano induzido pela isquemia-reperfusão orgânica, descrevendo os principais sistemas de defesa contra as EAO e algumas substâncias farmacológicas que, em diversos estudos experimentais, demonstram algum efeito protetor na lesão induzida pelas EAO durante a isquemia-reperfusão tecidual.
FONTE DAS ESPÉCIES ATIVAS DO OXIGÊNIO (EAO)
Normalmente, as EAO são produzidas constantemente por diversos tipos de tecidos através de reações redutivas do oxigênio molecular (O2), com a formação de uma série de elementos intermediários tóxicos e reativos (EAO), cujos principais representantes são o radical superóxido (O2), o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxil (OH) (STRYER,1996).
As principais fontes das EAO, nos seres vivos aeróbicos, são: as mitocôndrias (cadeia de transportes de elétrons), os sistemas de enzimas oxidantes (xantina oxidase, ciclo-oxigenase, lipoxigenase, monoaminoxidase, galactose oxidase), células fagocíticas (neutrófilos, monócitos, macrófagos) e reações auto-oxidantes, entre outras. Algumas fontes exógenas são capazes de estimular a geração de EAO: substâncias oxi-redutoras (paranquat, doxorrubicina), as drogas oxidantes (paracetamol, tetracloreto de carbono), o fumo a radiação ionizante e a luz solar (FERREIRA, 2000).
AÇÃO DAS PRINCIPAIS ESPÉCIES ATIVAS DO OXIGÊNIO (EAO)
Conforme já descritos, basicamente, são três as principais EAO decorrentes do metabolismo aeróbico: o radical superóxido (O2), o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxil (OH) .
O radical superóxido (O2) pode atuar como agente oxi-redutor, pelo potencial em receber ou doar elétrons, respectivamente. O radical O2 pode atacar a célula, diretamente por sua ação pró-inflamatória ou, indiretamente, através da geração de outros radicais (H2O2 e OH). A reação catalisada por íons Fé +2 que leva à formação do potente radical OH, através do O2 (reação de Haber-Weiss). Por outro lado, o radical O2 também pode reagir com lipídeos hidroperóxidos para formar radicais alcoxil (RO) (GUYTON & HALL, 2002).
A formação do peróxido de hidrogênio (H2O2) pode ocorrer por processo direto ou indireto . O primeiro relaciona-se à ação de oxidases encontradas nos peroxissomas (D-aminoácido oxidase, xantina oxidase, uricase, alfa-hidroxiácido oxidase e glicolato oxidase) envolvidas nas reações de oxidação de ácidos graxos, produção de hormônios esteróides, produção de lipídios em glândulas sebáceas, fagocitose, termogênese, entre outros processos (11). O segundo processo relaciona-se a dismutação do radical O2 através da redução univalente do O2 resultante da oxidação aeróbica de substratos com subseqüente ação da superóxido dismutase (SOD) (11). Em concentrações fisiológicas, o radical H2O2 parece não ser tóxico às células; entretanto, sua toxidade se tornaria relevante quando ocorre o seu contato com formas reduzidas de metais de transição (Fé +2 ou Cu+), originando o radical hidroxil (OH) – altamente danoso aos tecidos, através da reação de Fenton (GUYTON & HALL,2002).
SÍTIOS DE AÇÃO DAS ESPÉCIES ATIVAS DO OXIGÊNIO (EAO)
As EAO formadas durante os processos metabólicos agem nos compartimentos extra e intracelular, assim como sobre as membranas das células dos organismos . No espaço extracelular, as alterações estruturais e bioquímicas que estas espécies causam relacionam-se com o ataque aos glicosaminoglicanos, incluindo o ácido hialurônico, componente essencial do espaço intersticial e de líquidos especializados, como os líquidos vítreo e sinovial. A degradação destes componentes intersticiais, como ácido hialurônico e colágeno altera significativamente a permeabilidade celular e as características estruturais dos tecidos. No meio intracelular, ocorre o mecanismo de lipoperoxidação das membranas celulares (LPO), que é um processo fisiológico e contínuo nas membranas celulares, sendo um fator de remoção celular e um passo essencial na biossíntese de prostaglandinas e leucotrienos, bem como na fagocitose, pinocitose e lise de membranas de importantes organelas intracelulares, como as lisossomiais e mitocôndrias. Entretanto, a ruptura de lisossomos, com a conseqüente liberação de enzimas líticas, pode potencializar dano celular induzindo pelas EAO durante as reações de LPO. Desse modo, as membranas celulares, por serem formadas, em grande parte, por lipídios insaturados e proteínas, são particularmente vulneráveis ao ataque oxidativo das EAO. O ataque das EAO sobre as membranas pode ocasionar perda de fluidez da membrana e aumento da permeabilidade iônica (por exemplo, ao Ca+2). Por outro lado, enzimas e receptores ligados à membrana celular, podem ser inativados pelas reações de LPO (LEHNINGER, 1999).
SISTEMA DE DEFESA CONTRA AS ESPÉCIES ATIVAS DE OXIGÊNIO (EAO)
Processos enzimáticos e não-enzimáticos que ocorrem em nível celular, permeados pelo O2 levam a uma contínua produção de EAO, que necessita ser detoxificada pelo organismo, em função do seu potencial efeito lesivo. Os sistemas e as substâncias detoxificadoras das EAO recebem várias denominações, conforme seus mecanismos de ação: chama-se de scavenger, a substância capaz de neutralizar as EAO durante a fase de iniciação ou propagação da LPO; por outro lado, chama-se de quencher, a substância capaz de neutralizar as EAO pela absorção de energia emitida por essas espécies químicas (COTRAN et al.,2000).
Os principais sistemas enzimáticos de defesa contra as EAO, nos seres aeróbicos, são: a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (Gpx) (OTSUKA, 2004).
A SOD é maior sistema de defesa em células aeróbicas, combatendo os efeitos tóxicos do oxigênio. Está amplamente distribuída, na forma que contém cobre e zinco em seu sítio ativo (CuZn-SOD), presente no citosol das células eucarióticas ou na forma contendo manganês (Mn-SOD), localizada na matriz mitocondrial. Este complexo enzimático catalisa a dismutação do radical O2 para formar H2O2 . Esta reação ocorre espontaneamente em pH fisiológico, porém na presença da SOD sua velocidade é aumentada na ordem de 10.000(PEDROSO et al.,1998).
A catalase (CAT) é uma hemoproteína peroxidase específica para H2O2. Encontra-se amplamente distribuída em órgãos como fígado, rins, cérebro e eritrócitos (GUYTON & HALL, 2002).
A glutationa peroxidase (Gpx) tem ação peroxidase inespecífica para o H2O2 podendo ou não utilizar selênio como cofator. Possui intensa atividade no fígado e nos eritrócitos, moderada no coração, rins e pulmões e baixa nos músculos. Esta enzima é requerida para a reação de hidroperóxidos (ROOH) com glutationa reduzida (GSH), originado glutationa oxidada (GSSG) e o produto da redução do hidroperóxido (AIRES, 1999).
A exposição de animais e concentrações aumentadas de O2 freqüentemente aumenta a atividade da SOD, CAT e GPx em muitos tecidos, o que significa que a quantidade presente normalmente é suficiente somente para equilibrar taxas normais de produção das EAO e assim preservar a integridade celular e, por conseguinte dos órgãos (AIRES,1999).
Entre os sistemas não-enzimáticos temos uma subdivisão em hidrofóbicos, hidrofílicos e estruturais. Os ácidos graxos poliinsaturados das membranas lipídicas compõem a região hidrofóbica das células. O alfa-tocoferol (vitamina E) e os beta-carotenos, presentes nas membranas celulares, fornecem átomos de hidrogênio e podem prevenir reações de peroxidação propagadas em cadeia nas mesmas, evitando a desestruturação da arquitetura celular. Podem também se acoplar (quenchers) ao O2 e, assim, prevenir a formação de hidroperóxidos lipídicos, mantendo a permeabilidade e estabilidade das membranas celulares. Os carotenóides são compostos isoprenóides amplamente distribuídos na natureza onde desempenham um importante papel protetor das células e dos organismos. Por outro lado, os sistemas hidrofílicos são representados por substâncias químicas que agem impedindo as reações dos radicais livres que se processam em meios iônicos e aquosos dos compartimentos celulares. Ácidos ascórbicos, cisteína e glutationa reduzida, ceruplasmina, transferrrina, triptofano e histidina são os principais representantes, agindo principalmente no controle do radical hidroxil. O colesterol, intercalado no interior das membranas pelo seu tamanho e estrutura é o principal representante dos sistemas estruturais podendo proteger os ácidos graxos da lesão peroxidativa. A localização de certos peroxissomos e mitocôndrias, com seus mecanismos especializados de scavengers, parecem ter papel importante no controle de reações causadas pelos radicais livres (LEHNINGER, 1999).
Portanto, antioxidantes endógenos protetores operam continuamente como mecanismo de defesa fisiológico contra as EAO que são gerados por processos metabólicos que normalmente ocorrem para manter a integridade celular e também quando solicitados em situações de estresse como o que ocorre na isquemia-reperfusão tecidual (COTRAN et al. 2000).
ISQUEMIA E REPERFUSÃO COMO FONTES DE ESPÉCIE ATIVAS DE OXIGÊNIO (EAO)
A isquemia e reperfusão de órgãos têm sido amplamente reconhecidas como fonte importantes de EAO, com conseqüências deletérias sobre estes órgãos. Acredita-se que a isquemia seja menos lesiva aos tecidos quando comparada ao grande aporte de O2 após re-estabelecida a circulação arterial, o que leva à formação das EAO e suas conseqüências. Após um período de isquemia, a formação das EAO cresce dentro de minutos durante a reperfusão, quando atinge um pico e, a seguir declina lentamente para uma linha de base. Como foi comentado anteriormente, as EAO danificam as membranas celulares através da peroxidação de ácidos graxos no interior da estrutura dos fosfolipídeos – elementos fundamentais da arquitetura das membranas celulares. Durante este processo, radicais peróxido e hidroperóxido dos lipídios membranas, juntamente com outros produtos da fragmentação das membranas são formados. Assim, a reatividade do radical livre tem uma tendência a gerar uma reação em cascata para produzir mais EAO, culminado em efeitos destrutivos sobre a célula, em um verdadeiro ciclo vicioso de lesão celular (LEHNINGER, 1999).
Os mecanismos propostos com responsáveis pela degeneração das EAO, sob circunstâncias incluem a lesão mitocondrial, a atividade da xantina oxidase (XO), a via do ácido aracdônico, a via do óxido nítrico (NO) e o acúmulo depolimorfonucleares teciduais (AIRES, 1999).
Diminuindo o aporte de O2 para níveis críticos ao ambiente aeróbico, as células, numa tentativa de adaptação, desenvolvem um metabolismo anaeróbico, consumindo as reservas de glicogênio e energia (ATP), visando a superar esta situação de estresse, provocado pela privação de O2. No período de reperfusão, as células expostas a grandes tensões de O2 precisam de um rápido reajuste de seu metabolismo para uma situação de metabolismo aeróbico. Estas concentrações altas de O2 em uma situação de funcionamento inadequado das mitocôndrias (lesadas durante o período isquêmico), juntamente com a diminuição dos sistemas protetores as EAO, culminando em lesões das membranas e morte celular. Tal fato foi evidenciado em estudos posteriores, onde se obteve concentrações de malondialdeído (MDA) – produto da peroxidação de ácidos graxos em tecidos isquêmicos e reperfundidos significativamente superiores aos níveis de MDA nos tecidos isquêmicos e não reperfundidos (LEHNINGER, 1999).
VIA DA XANTINA OXIDASE
Segundo LEHNINGER (1999) o mecanismo da xantina oxidase é o mais plenamente estabelecido como gerador de EAO na assim chamada síndrome isquêmica-reperfusional. Entretanto, outros autores não têm conseguido reproduzir os mesmos resultados, questionando a importância de tal via na geração das EAO durante a isquemia reperfusão tecidual.
A forma nativa da enzima xantina deidrogenase, enzima que utiliza a nicotinamida (tipo D) adenina (NAD) como aceptor de elétrons e, portanto, não possui capacidade de gerar EAO. Em tecidos normais, 90% da atividade desta enzima existem sob a forma do tipo D. Nas situações de isquemia, hipóxia ou qualquer estado de baixo nível energético a forma tipo D é convertida na forma tipo O, enzima que utiliza o O2 como aceptor de elétrons e, portanto, capaz de gerar EAO, decorrente de uma oxidação sulfidrílica ou proteólise limitada. Igualmente, nestas situações, ocorre um decréscimo do conteúdo de ATP, resultando do baixo nível energético ou do consumo de seus substratos em uma situação de anaerobiose. O ATP, na tentativa de manter a atividade energética da célula, é catabolisando em adenosina difostatada (ADP), adenosina monofosfatada (AMP), inosina e, finalmente, em hipoxantina, que compões substrato para ação da xantina oxidase. Além disso, com níveis energéticos extremamente baixos, a células é incapaz demanter os gradientes iônicos, elevando, por conseguinte, o cálcio citosólico. Concentrações citoplasmática elevadas de cálcio citosólio podem ser um dos fatores que disparam uma série de eventos bioquímicos, entre os quais destaca-se a ativação de proteases cálcio-dependente que, atuando sobre a xantina deidrogenase, convertem-se em sua forma oxidase. Entretanto, nesta fase, a xantina oxidase (XO) ainda não é capaz de produzir EAO. Durante o período isquêmico, já pode ter ocorrido dano tecidual em função das alterações iônicas do cálcio citosólico e da proteólise (lesão isquêmica). Entretanto, depois de restabelecida a reperfusão sanguínea, a oxidação da hipoxantina e xantina é processada e altas proporções de EAO são formadas conseqüentemente, ultrapassando a capacidade de detoxificação pelos mecanismos endógenos.
O mecanismo de formação das EAO neste processo é explicado pelo fato de existir a enzima XO utilizar o O2 como um aceptor de elétrons, formando assim o radical. O radical superóxido (O2), assim formado, segue rotas metabólicas destinadas à formação de outros radicais. A maior toxidade do radical O2 provém dos produtos de sua transformação, ou seja, de sua metabolização em H2O2, conforme salientado anteriormente. O radical peróxido assim formado pode ser detoxidicado pela catalase; entretanto, quando em contato com ferro e O2 pode reagir formando o radical OH, extremamente reativo, que associado aos anteriores pode agir sobre os ácidos graxos dos fosfolipídios das membranas celulares determinando a lipoperoxidação.
VIA DO ÓXIDO NÍTRICO E DO ÁCIDO ARAQUIDÔNICO
Segundo LEHNINGER (1999) a inter-relação das EAO com a via do óxido nítrico (NO), levando à formação do potente radical OH pode ser compreendida pela seqüência de eventos que se estabelecem em cadeia. O NO teria uma atividade modulatória (down-regulation) da interação entre leucócitos e células endoteliais, causando vasodilatação, além de diminuir a migração e agregação leucocitária (neutrófilos) e plaquetária. Apresentando um elétron desemparelhado, o NO poderia ser aceptor do elétron do radical O2 e, assim este radical. Sob condições normais, quando a geração orgânica de NO com o radical livre é extremamente rápida, formando peroxinitrito (ONOO). Um importante agente causador de lipoperoxidação das membranas celulares (LPO). Uma conjugação ácida deste forma o ácido peroxinitroso. Entretanto, este ácido apresenta uma estabilidade muito lábil, sendo rapidamente decomposto para formar nitrato (NO3) resulta no radical NO2 com a liberação do radical OH, restabelecendo-se, então, a via de injúria provocada pelas EAO.
Se, contudo, a relação O2 /NO aumenta, isto é, por superprodução de superóxido ou por diminuição da produção de NO (inibidores da óxido nítrico sintase – L- NANME – N – nitro – L – arginina metil éster), o O2 é espontânea ou enzimáticamente deslocado para reação de dismutação, com conseqüente formação de H2O2. A produção excessiva de O2 e de H2O2 em presença da atividade redox ativa, tal como ferro, promoverá a formação de OH (reação de fenton), com conseqüente ativação oxidante-dependente da via do ácido araquidônico e a subseqüente liberação de fosfolipase A2 e formação de mediadores pró-inflamatórios, como leucotrienos e PAF, aumentando a migração de polimorfonucleares nas vênulas pós-capilares e o efluxo de proteínas na microvasculatura.
O uso de substância quelantes de ferro de ferro, como a desferoxamia, de inibidores do óxido nítrico sintase (NOS) e de diversos antiinflamatórios (corticóides, diclofenaco de sódio) e de substância detoxidicadoras das espécies radicais, interferindo em etapas especódicas destas rotas inter-relacionadas, efetuadas em diversos experimentos, comprovam os mecanismos envolvidos na geração, no destino e nas ações das EAO formadas (OTSUKA, 2004).
EFEITOS DE SUBSTÂNCIAS FARMACOLÓGICAS SOBRE AS EAO DURANTE A ISQUEMIA-REPERFUSÃO
TECIDUAL
Um grande número de substâncias farmacológicas, baseadas nos mecanismos hipotéticos de formação das EAO, têm sido utilizadas com intuito de reduzir a formação das mesmas EAO e, conseqüentemente, reduzir a injúria celular decorrente da isquemia e reperfusão. Entre estas, citam-se a coezima Q10 alopurinol, alfa-tocoferol, glutationa, ascorbato e dimetiltiouréia que agiruam especificamente sobre a formação das EAO. Substância como a N-acetilcisteína, agindo no sentido de promover o aumento da glutationa intracelular, têm sido referidas também como possuidoras de um potencial benéfico. Outras, como glucagon, dopamina, hidralizina, cloridrato magnesiano de adenosina trifosfatada (ATP – MgCI2) e prostaglandinas E1, atuariam melhorando o fluxo sanguíneo ao órgão e evitando o fenômeno de vasoespasmos pós-isquêmico. Sustâncias como corticosteróides e antiinflamatórios não esteróides agiriam estabilizando a membrana celular e de elementos subcelulares. O nitroprussiato de sódio e L-arginina agindo pela mediação do óxido nítrico diminuiria a interação leucocitária com a superfície endotelial, reduzindo assim, o efluxo celular inflamatório. A heparina, em função de sua cão anticiagulante, que evita a deposição de fibrina , e através de mecanismo ainda não bem definidos, também tem sido proposta côo possuindo ação protetora contra as EAO formadas na isquemia e reperfusão. Os bloqueadores dos canais de cálcio (lidoflazina, verapamil) e drogas como a clorpromazina, que interferem no influxo de cálcio durante o processo isquêmico, também têm sido apresentados como elementos capazes de exercer algum grau de proteção de órgãos e tecidos contra as EAO. Mais recentemente, a ciclosporina, agindo especificamente nos poros mitocontriais, evitando o acúmulo de cálcio no interior destas organelas e , conseqüentemente, mantendo a sua homeostase foi postulada como tendo efeito protetor em situações de isquemia e reperfusão, haja visto serem as mitocôndrias o principal sítio energético das células. Além desses , pode-se citar, ainda, o efeito protetor verificado com o 21 – aminoesteróide U74006F (inibidor da lipoperoxidação dependente de Fe+2 , o probucol (inibidor da LPO der lipoproteínas de baixa densidade), e com o ATP (importante fonte de energia para o tecido isquêmico) (AIRES,1999).
Diversos estudos experimentais têm sido efetuados no sentido de respaldar a teoria da xantina oxidase na geração das EAO durante a isquemia e reperfusão tecidual. Assim, drogas como o alopurinol – inibidor da xantina oxidase – demonstram efeitos protetor quando em comparação a grupos não-tratados durante o evento isquêmico-reperfusional. Estudos em diferentes órgãos, como fígado, coração, rins, músculo esquelético, pâncreas e pele de ratos, tem evidenciado as mesmas características gerais envolvidas no mecanismo de geração de EAO mediadas pela via da xantina oxidase. No campo da cirurgia experimental, já evidenciamos e efeito benéfico do alopurinol na isquemia-reperfusão hepática e renal. Mais recentemente, verificamos o papel protetor de outras substâncias, tal qual o atocoferol, bem como a importância da via L-arginina/NO na isquemia-reperfusão em ratos(LEHNINGER,1999).
CONCLUSÃO
A isquemia-reperfusão tecidual é amplamente utilizada em diversos procedimentos cirúrgicos, tais quais as recessões parciais de órgãos (nefrectomias parciais), cirurgias de revascularização de órgãos, bem como nas cirurgias de transplante. Em vista disso, é de extrema importância o conhecimento, a nível molecular e celular, da fisiopatogenia que envolve os mecanismos de injúria tecidual decorrentes de tal situação. Através dessa breve revisão, pôde-se ter uma idéia da participação das espécies ativas de oxigênio (EAO) no processo de isquemia-reperfusão tecidual. Esses conhecimentos nos possibilitam novos rumos em pesquisas posteriores que visem diminuir as repercussões deletérias da isquemia- reperfusão em órgãos, utilizando substâncias farmacológicas, em estudos experimentais, que interfiram na produção ou na ação das EAO sobre os órgãos afetados pelo processo. Conseqüentemente, resultados satisfatórios dentro desse contexto poderão estimular o emprego de tais substâncias no setor clínico-cirúrgico.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AIRES, M.M. Fisiologia.Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 1999.
COTRAN, R.S.;KUMAR,V.e ROBBINS,S.L. Robbins – Patologia Estrutural e Funcional.Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 2000.
FERREIRA, C.P. Bioquímica.São Paulo: MNP Editora,2000.
GUYTON, A.C. e HALL,J.E. Tratado de Fisiologia Médica.Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 2002.
LEHNINGER,A .L. Bioquímica.São Paulo:Edgard Blucher,1999.
OTSUKA, P.A .L. Fisiopatologia.Rio de Janeiro: Guanabra-Koogan,2004.
PEDROSO, E.R.P.;ROCHA,M.O .C. e SILVA, O.A. Clínica Médica : os princípios da prática ambulatorial.São Paulo: Atheneu, 1998.
STRYER, L. Bioquímica.Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 1996.
Espécie ativa de oxigênio (EAO, também conhecida como radical livre de oxigênio (RLO), é qualquer espécie química capaz de existência independente, com grande poder oxi-redutivo e que contém um ou mais elétrons desemparelhados na sua camada mais externa . As EAO apresentam uma vida média muito curta e, devido à sua alta reatividade, a maioria dessas espécies químicas existe apenas em baixas concentrações (FERREIRA,2000).
As EAO podem estar envolvidas na fisiopatogenia de diferentes situações: toxidade exógena (radiação ionizante, agentes quimioterapicos, tetracloreto de carbono, paraquat, carcinógenos químicos), síndromes de hiperoxigenação (toxidade pulmonar por oxigênio hiperbárico, fibroplasia retrolental), síndromes isquêmico-reperfusionais (infarto do miocárdio, cardioplegia cirúrgica, preservação de órgãos para transplantes, isquemia cerebral, transferência de retalhos livres de pele e músculos), desordens inflamatórias (glomerulonefrites, vasculites e doenças autoimunes), choque hemorrágico, sobrecarga de ferro (hemocromatose, talassemias), deficiências nutricionais, álcool, câncer e amiloidose, entre outros . Doenças dos sistemas sanguíneo, respiratório, cardiovascular, urinário, gastrintestinal, nervoso central, visual e cutâneo têm sido referidas como tendo associação ou mediação por EAO (LEHNINGER, 1999).
Assim, o objetivo desta revisão é apresentar aspectos gerais sobre as EAO, salientando o envolvimento de tais espécies químicas no dano induzido pela isquemia-reperfusão orgânica, descrevendo os principais sistemas de defesa contra as EAO e algumas substâncias farmacológicas que, em diversos estudos experimentais, demonstram algum efeito protetor na lesão induzida pelas EAO durante a isquemia-reperfusão tecidual.
FONTE DAS ESPÉCIES ATIVAS DO OXIGÊNIO (EAO)
Normalmente, as EAO são produzidas constantemente por diversos tipos de tecidos através de reações redutivas do oxigênio molecular (O2), com a formação de uma série de elementos intermediários tóxicos e reativos (EAO), cujos principais representantes são o radical superóxido (O2), o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxil (OH) (STRYER,1996).
As principais fontes das EAO, nos seres vivos aeróbicos, são: as mitocôndrias (cadeia de transportes de elétrons), os sistemas de enzimas oxidantes (xantina oxidase, ciclo-oxigenase, lipoxigenase, monoaminoxidase, galactose oxidase), células fagocíticas (neutrófilos, monócitos, macrófagos) e reações auto-oxidantes, entre outras. Algumas fontes exógenas são capazes de estimular a geração de EAO: substâncias oxi-redutoras (paranquat, doxorrubicina), as drogas oxidantes (paracetamol, tetracloreto de carbono), o fumo a radiação ionizante e a luz solar (FERREIRA, 2000).
AÇÃO DAS PRINCIPAIS ESPÉCIES ATIVAS DO OXIGÊNIO (EAO)
Conforme já descritos, basicamente, são três as principais EAO decorrentes do metabolismo aeróbico: o radical superóxido (O2), o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxil (OH) .
O radical superóxido (O2) pode atuar como agente oxi-redutor, pelo potencial em receber ou doar elétrons, respectivamente. O radical O2 pode atacar a célula, diretamente por sua ação pró-inflamatória ou, indiretamente, através da geração de outros radicais (H2O2 e OH). A reação catalisada por íons Fé +2 que leva à formação do potente radical OH, através do O2 (reação de Haber-Weiss). Por outro lado, o radical O2 também pode reagir com lipídeos hidroperóxidos para formar radicais alcoxil (RO) (GUYTON & HALL, 2002).
A formação do peróxido de hidrogênio (H2O2) pode ocorrer por processo direto ou indireto . O primeiro relaciona-se à ação de oxidases encontradas nos peroxissomas (D-aminoácido oxidase, xantina oxidase, uricase, alfa-hidroxiácido oxidase e glicolato oxidase) envolvidas nas reações de oxidação de ácidos graxos, produção de hormônios esteróides, produção de lipídios em glândulas sebáceas, fagocitose, termogênese, entre outros processos (11). O segundo processo relaciona-se a dismutação do radical O2 através da redução univalente do O2 resultante da oxidação aeróbica de substratos com subseqüente ação da superóxido dismutase (SOD) (11). Em concentrações fisiológicas, o radical H2O2 parece não ser tóxico às células; entretanto, sua toxidade se tornaria relevante quando ocorre o seu contato com formas reduzidas de metais de transição (Fé +2 ou Cu+), originando o radical hidroxil (OH) – altamente danoso aos tecidos, através da reação de Fenton (GUYTON & HALL,2002).
SÍTIOS DE AÇÃO DAS ESPÉCIES ATIVAS DO OXIGÊNIO (EAO)
As EAO formadas durante os processos metabólicos agem nos compartimentos extra e intracelular, assim como sobre as membranas das células dos organismos . No espaço extracelular, as alterações estruturais e bioquímicas que estas espécies causam relacionam-se com o ataque aos glicosaminoglicanos, incluindo o ácido hialurônico, componente essencial do espaço intersticial e de líquidos especializados, como os líquidos vítreo e sinovial. A degradação destes componentes intersticiais, como ácido hialurônico e colágeno altera significativamente a permeabilidade celular e as características estruturais dos tecidos. No meio intracelular, ocorre o mecanismo de lipoperoxidação das membranas celulares (LPO), que é um processo fisiológico e contínuo nas membranas celulares, sendo um fator de remoção celular e um passo essencial na biossíntese de prostaglandinas e leucotrienos, bem como na fagocitose, pinocitose e lise de membranas de importantes organelas intracelulares, como as lisossomiais e mitocôndrias. Entretanto, a ruptura de lisossomos, com a conseqüente liberação de enzimas líticas, pode potencializar dano celular induzindo pelas EAO durante as reações de LPO. Desse modo, as membranas celulares, por serem formadas, em grande parte, por lipídios insaturados e proteínas, são particularmente vulneráveis ao ataque oxidativo das EAO. O ataque das EAO sobre as membranas pode ocasionar perda de fluidez da membrana e aumento da permeabilidade iônica (por exemplo, ao Ca+2). Por outro lado, enzimas e receptores ligados à membrana celular, podem ser inativados pelas reações de LPO (LEHNINGER, 1999).
SISTEMA DE DEFESA CONTRA AS ESPÉCIES ATIVAS DE OXIGÊNIO (EAO)
Processos enzimáticos e não-enzimáticos que ocorrem em nível celular, permeados pelo O2 levam a uma contínua produção de EAO, que necessita ser detoxificada pelo organismo, em função do seu potencial efeito lesivo. Os sistemas e as substâncias detoxificadoras das EAO recebem várias denominações, conforme seus mecanismos de ação: chama-se de scavenger, a substância capaz de neutralizar as EAO durante a fase de iniciação ou propagação da LPO; por outro lado, chama-se de quencher, a substância capaz de neutralizar as EAO pela absorção de energia emitida por essas espécies químicas (COTRAN et al.,2000).
Os principais sistemas enzimáticos de defesa contra as EAO, nos seres aeróbicos, são: a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (Gpx) (OTSUKA, 2004).
A SOD é maior sistema de defesa em células aeróbicas, combatendo os efeitos tóxicos do oxigênio. Está amplamente distribuída, na forma que contém cobre e zinco em seu sítio ativo (CuZn-SOD), presente no citosol das células eucarióticas ou na forma contendo manganês (Mn-SOD), localizada na matriz mitocondrial. Este complexo enzimático catalisa a dismutação do radical O2 para formar H2O2 . Esta reação ocorre espontaneamente em pH fisiológico, porém na presença da SOD sua velocidade é aumentada na ordem de 10.000(PEDROSO et al.,1998).
A catalase (CAT) é uma hemoproteína peroxidase específica para H2O2. Encontra-se amplamente distribuída em órgãos como fígado, rins, cérebro e eritrócitos (GUYTON & HALL, 2002).
A glutationa peroxidase (Gpx) tem ação peroxidase inespecífica para o H2O2 podendo ou não utilizar selênio como cofator. Possui intensa atividade no fígado e nos eritrócitos, moderada no coração, rins e pulmões e baixa nos músculos. Esta enzima é requerida para a reação de hidroperóxidos (ROOH) com glutationa reduzida (GSH), originado glutationa oxidada (GSSG) e o produto da redução do hidroperóxido (AIRES, 1999).
A exposição de animais e concentrações aumentadas de O2 freqüentemente aumenta a atividade da SOD, CAT e GPx em muitos tecidos, o que significa que a quantidade presente normalmente é suficiente somente para equilibrar taxas normais de produção das EAO e assim preservar a integridade celular e, por conseguinte dos órgãos (AIRES,1999).
Entre os sistemas não-enzimáticos temos uma subdivisão em hidrofóbicos, hidrofílicos e estruturais. Os ácidos graxos poliinsaturados das membranas lipídicas compõem a região hidrofóbica das células. O alfa-tocoferol (vitamina E) e os beta-carotenos, presentes nas membranas celulares, fornecem átomos de hidrogênio e podem prevenir reações de peroxidação propagadas em cadeia nas mesmas, evitando a desestruturação da arquitetura celular. Podem também se acoplar (quenchers) ao O2 e, assim, prevenir a formação de hidroperóxidos lipídicos, mantendo a permeabilidade e estabilidade das membranas celulares. Os carotenóides são compostos isoprenóides amplamente distribuídos na natureza onde desempenham um importante papel protetor das células e dos organismos. Por outro lado, os sistemas hidrofílicos são representados por substâncias químicas que agem impedindo as reações dos radicais livres que se processam em meios iônicos e aquosos dos compartimentos celulares. Ácidos ascórbicos, cisteína e glutationa reduzida, ceruplasmina, transferrrina, triptofano e histidina são os principais representantes, agindo principalmente no controle do radical hidroxil. O colesterol, intercalado no interior das membranas pelo seu tamanho e estrutura é o principal representante dos sistemas estruturais podendo proteger os ácidos graxos da lesão peroxidativa. A localização de certos peroxissomos e mitocôndrias, com seus mecanismos especializados de scavengers, parecem ter papel importante no controle de reações causadas pelos radicais livres (LEHNINGER, 1999).
Portanto, antioxidantes endógenos protetores operam continuamente como mecanismo de defesa fisiológico contra as EAO que são gerados por processos metabólicos que normalmente ocorrem para manter a integridade celular e também quando solicitados em situações de estresse como o que ocorre na isquemia-reperfusão tecidual (COTRAN et al. 2000).
ISQUEMIA E REPERFUSÃO COMO FONTES DE ESPÉCIE ATIVAS DE OXIGÊNIO (EAO)
A isquemia e reperfusão de órgãos têm sido amplamente reconhecidas como fonte importantes de EAO, com conseqüências deletérias sobre estes órgãos. Acredita-se que a isquemia seja menos lesiva aos tecidos quando comparada ao grande aporte de O2 após re-estabelecida a circulação arterial, o que leva à formação das EAO e suas conseqüências. Após um período de isquemia, a formação das EAO cresce dentro de minutos durante a reperfusão, quando atinge um pico e, a seguir declina lentamente para uma linha de base. Como foi comentado anteriormente, as EAO danificam as membranas celulares através da peroxidação de ácidos graxos no interior da estrutura dos fosfolipídeos – elementos fundamentais da arquitetura das membranas celulares. Durante este processo, radicais peróxido e hidroperóxido dos lipídios membranas, juntamente com outros produtos da fragmentação das membranas são formados. Assim, a reatividade do radical livre tem uma tendência a gerar uma reação em cascata para produzir mais EAO, culminado em efeitos destrutivos sobre a célula, em um verdadeiro ciclo vicioso de lesão celular (LEHNINGER, 1999).
Os mecanismos propostos com responsáveis pela degeneração das EAO, sob circunstâncias incluem a lesão mitocondrial, a atividade da xantina oxidase (XO), a via do ácido aracdônico, a via do óxido nítrico (NO) e o acúmulo depolimorfonucleares teciduais (AIRES, 1999).
Diminuindo o aporte de O2 para níveis críticos ao ambiente aeróbico, as células, numa tentativa de adaptação, desenvolvem um metabolismo anaeróbico, consumindo as reservas de glicogênio e energia (ATP), visando a superar esta situação de estresse, provocado pela privação de O2. No período de reperfusão, as células expostas a grandes tensões de O2 precisam de um rápido reajuste de seu metabolismo para uma situação de metabolismo aeróbico. Estas concentrações altas de O2 em uma situação de funcionamento inadequado das mitocôndrias (lesadas durante o período isquêmico), juntamente com a diminuição dos sistemas protetores as EAO, culminando em lesões das membranas e morte celular. Tal fato foi evidenciado em estudos posteriores, onde se obteve concentrações de malondialdeído (MDA) – produto da peroxidação de ácidos graxos em tecidos isquêmicos e reperfundidos significativamente superiores aos níveis de MDA nos tecidos isquêmicos e não reperfundidos (LEHNINGER, 1999).
VIA DA XANTINA OXIDASE
Segundo LEHNINGER (1999) o mecanismo da xantina oxidase é o mais plenamente estabelecido como gerador de EAO na assim chamada síndrome isquêmica-reperfusional. Entretanto, outros autores não têm conseguido reproduzir os mesmos resultados, questionando a importância de tal via na geração das EAO durante a isquemia reperfusão tecidual.
A forma nativa da enzima xantina deidrogenase, enzima que utiliza a nicotinamida (tipo D) adenina (NAD) como aceptor de elétrons e, portanto, não possui capacidade de gerar EAO. Em tecidos normais, 90% da atividade desta enzima existem sob a forma do tipo D. Nas situações de isquemia, hipóxia ou qualquer estado de baixo nível energético a forma tipo D é convertida na forma tipo O, enzima que utiliza o O2 como aceptor de elétrons e, portanto, capaz de gerar EAO, decorrente de uma oxidação sulfidrílica ou proteólise limitada. Igualmente, nestas situações, ocorre um decréscimo do conteúdo de ATP, resultando do baixo nível energético ou do consumo de seus substratos em uma situação de anaerobiose. O ATP, na tentativa de manter a atividade energética da célula, é catabolisando em adenosina difostatada (ADP), adenosina monofosfatada (AMP), inosina e, finalmente, em hipoxantina, que compões substrato para ação da xantina oxidase. Além disso, com níveis energéticos extremamente baixos, a células é incapaz demanter os gradientes iônicos, elevando, por conseguinte, o cálcio citosólico. Concentrações citoplasmática elevadas de cálcio citosólio podem ser um dos fatores que disparam uma série de eventos bioquímicos, entre os quais destaca-se a ativação de proteases cálcio-dependente que, atuando sobre a xantina deidrogenase, convertem-se em sua forma oxidase. Entretanto, nesta fase, a xantina oxidase (XO) ainda não é capaz de produzir EAO. Durante o período isquêmico, já pode ter ocorrido dano tecidual em função das alterações iônicas do cálcio citosólico e da proteólise (lesão isquêmica). Entretanto, depois de restabelecida a reperfusão sanguínea, a oxidação da hipoxantina e xantina é processada e altas proporções de EAO são formadas conseqüentemente, ultrapassando a capacidade de detoxificação pelos mecanismos endógenos.
O mecanismo de formação das EAO neste processo é explicado pelo fato de existir a enzima XO utilizar o O2 como um aceptor de elétrons, formando assim o radical. O radical superóxido (O2), assim formado, segue rotas metabólicas destinadas à formação de outros radicais. A maior toxidade do radical O2 provém dos produtos de sua transformação, ou seja, de sua metabolização em H2O2, conforme salientado anteriormente. O radical peróxido assim formado pode ser detoxidicado pela catalase; entretanto, quando em contato com ferro e O2 pode reagir formando o radical OH, extremamente reativo, que associado aos anteriores pode agir sobre os ácidos graxos dos fosfolipídios das membranas celulares determinando a lipoperoxidação.
VIA DO ÓXIDO NÍTRICO E DO ÁCIDO ARAQUIDÔNICO
Segundo LEHNINGER (1999) a inter-relação das EAO com a via do óxido nítrico (NO), levando à formação do potente radical OH pode ser compreendida pela seqüência de eventos que se estabelecem em cadeia. O NO teria uma atividade modulatória (down-regulation) da interação entre leucócitos e células endoteliais, causando vasodilatação, além de diminuir a migração e agregação leucocitária (neutrófilos) e plaquetária. Apresentando um elétron desemparelhado, o NO poderia ser aceptor do elétron do radical O2 e, assim este radical. Sob condições normais, quando a geração orgânica de NO com o radical livre é extremamente rápida, formando peroxinitrito (ONOO). Um importante agente causador de lipoperoxidação das membranas celulares (LPO). Uma conjugação ácida deste forma o ácido peroxinitroso. Entretanto, este ácido apresenta uma estabilidade muito lábil, sendo rapidamente decomposto para formar nitrato (NO3) resulta no radical NO2 com a liberação do radical OH, restabelecendo-se, então, a via de injúria provocada pelas EAO.
Se, contudo, a relação O2 /NO aumenta, isto é, por superprodução de superóxido ou por diminuição da produção de NO (inibidores da óxido nítrico sintase – L- NANME – N – nitro – L – arginina metil éster), o O2 é espontânea ou enzimáticamente deslocado para reação de dismutação, com conseqüente formação de H2O2. A produção excessiva de O2 e de H2O2 em presença da atividade redox ativa, tal como ferro, promoverá a formação de OH (reação de fenton), com conseqüente ativação oxidante-dependente da via do ácido araquidônico e a subseqüente liberação de fosfolipase A2 e formação de mediadores pró-inflamatórios, como leucotrienos e PAF, aumentando a migração de polimorfonucleares nas vênulas pós-capilares e o efluxo de proteínas na microvasculatura.
O uso de substância quelantes de ferro de ferro, como a desferoxamia, de inibidores do óxido nítrico sintase (NOS) e de diversos antiinflamatórios (corticóides, diclofenaco de sódio) e de substância detoxidicadoras das espécies radicais, interferindo em etapas especódicas destas rotas inter-relacionadas, efetuadas em diversos experimentos, comprovam os mecanismos envolvidos na geração, no destino e nas ações das EAO formadas (OTSUKA, 2004).
EFEITOS DE SUBSTÂNCIAS FARMACOLÓGICAS SOBRE AS EAO DURANTE A ISQUEMIA-REPERFUSÃO
TECIDUAL
Um grande número de substâncias farmacológicas, baseadas nos mecanismos hipotéticos de formação das EAO, têm sido utilizadas com intuito de reduzir a formação das mesmas EAO e, conseqüentemente, reduzir a injúria celular decorrente da isquemia e reperfusão. Entre estas, citam-se a coezima Q10 alopurinol, alfa-tocoferol, glutationa, ascorbato e dimetiltiouréia que agiruam especificamente sobre a formação das EAO. Substância como a N-acetilcisteína, agindo no sentido de promover o aumento da glutationa intracelular, têm sido referidas também como possuidoras de um potencial benéfico. Outras, como glucagon, dopamina, hidralizina, cloridrato magnesiano de adenosina trifosfatada (ATP – MgCI2) e prostaglandinas E1, atuariam melhorando o fluxo sanguíneo ao órgão e evitando o fenômeno de vasoespasmos pós-isquêmico. Sustâncias como corticosteróides e antiinflamatórios não esteróides agiriam estabilizando a membrana celular e de elementos subcelulares. O nitroprussiato de sódio e L-arginina agindo pela mediação do óxido nítrico diminuiria a interação leucocitária com a superfície endotelial, reduzindo assim, o efluxo celular inflamatório. A heparina, em função de sua cão anticiagulante, que evita a deposição de fibrina , e através de mecanismo ainda não bem definidos, também tem sido proposta côo possuindo ação protetora contra as EAO formadas na isquemia e reperfusão. Os bloqueadores dos canais de cálcio (lidoflazina, verapamil) e drogas como a clorpromazina, que interferem no influxo de cálcio durante o processo isquêmico, também têm sido apresentados como elementos capazes de exercer algum grau de proteção de órgãos e tecidos contra as EAO. Mais recentemente, a ciclosporina, agindo especificamente nos poros mitocontriais, evitando o acúmulo de cálcio no interior destas organelas e , conseqüentemente, mantendo a sua homeostase foi postulada como tendo efeito protetor em situações de isquemia e reperfusão, haja visto serem as mitocôndrias o principal sítio energético das células. Além desses , pode-se citar, ainda, o efeito protetor verificado com o 21 – aminoesteróide U74006F (inibidor da lipoperoxidação dependente de Fe+2 , o probucol (inibidor da LPO der lipoproteínas de baixa densidade), e com o ATP (importante fonte de energia para o tecido isquêmico) (AIRES,1999).
Diversos estudos experimentais têm sido efetuados no sentido de respaldar a teoria da xantina oxidase na geração das EAO durante a isquemia e reperfusão tecidual. Assim, drogas como o alopurinol – inibidor da xantina oxidase – demonstram efeitos protetor quando em comparação a grupos não-tratados durante o evento isquêmico-reperfusional. Estudos em diferentes órgãos, como fígado, coração, rins, músculo esquelético, pâncreas e pele de ratos, tem evidenciado as mesmas características gerais envolvidas no mecanismo de geração de EAO mediadas pela via da xantina oxidase. No campo da cirurgia experimental, já evidenciamos e efeito benéfico do alopurinol na isquemia-reperfusão hepática e renal. Mais recentemente, verificamos o papel protetor de outras substâncias, tal qual o atocoferol, bem como a importância da via L-arginina/NO na isquemia-reperfusão em ratos(LEHNINGER,1999).
CONCLUSÃO
A isquemia-reperfusão tecidual é amplamente utilizada em diversos procedimentos cirúrgicos, tais quais as recessões parciais de órgãos (nefrectomias parciais), cirurgias de revascularização de órgãos, bem como nas cirurgias de transplante. Em vista disso, é de extrema importância o conhecimento, a nível molecular e celular, da fisiopatogenia que envolve os mecanismos de injúria tecidual decorrentes de tal situação. Através dessa breve revisão, pôde-se ter uma idéia da participação das espécies ativas de oxigênio (EAO) no processo de isquemia-reperfusão tecidual. Esses conhecimentos nos possibilitam novos rumos em pesquisas posteriores que visem diminuir as repercussões deletérias da isquemia- reperfusão em órgãos, utilizando substâncias farmacológicas, em estudos experimentais, que interfiram na produção ou na ação das EAO sobre os órgãos afetados pelo processo. Conseqüentemente, resultados satisfatórios dentro desse contexto poderão estimular o emprego de tais substâncias no setor clínico-cirúrgico.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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